[发明专利]一种测定肠道内容物或粪便中短链脂肪酸含量的方法

说明书

本发明公开了一种测定肠道内容物或粪便中短链脂肪酸含量的方法，采用乙醚对样品进行预处理，然后用气相色谱法测定样品中的短链脂肪酸含量；所述预处理温度为2～8℃。本发明不需要其他衍生化前处理步骤，前处理时间短于15min，测试时长短于20min；低温可有效降低短链脂肪酸的挥发损失，回收率高为98.10±0.29％～101.30±0.27％；采用本发明方法检测限能低至0.0036μL/mL，定量限能低至0.0041μL/mL，对于短链脂肪酸的检测更为准确和高效。

技术领域

本发明涉及一种测定肠道内容物或粪便中短链脂肪酸含量的方法，属于生物样品检测领域。

背景技术

肠道不仅是人体消化吸收的重要场所，同时也是最大的免疫器官，在维持正常免疫防御功能中发挥着极其重要的作用。人体肠道为微生物提供了良好的栖息环境，居住在人体胃肠道中的微生物群体可达数十万亿，是人体细胞数量的10倍。有超过1000个菌种已经被鉴定确认，所有个体中均存在的微生物大约有160种。肠道微生物的基因组中包括约300万个基因，是人类基因组的150倍，具有人体自身不具备的代谢功能。肠道微生态是指肠道正常菌群与其宿主之间相互作用、相互影响的统一整体。目前，越来越多的研究表明，肠道微生态与宿主健康存在着直接或者间接的联系，肠道微生态功能的失衡，影响着宿主健康，促使炎症性肠病、心脑血管疾病、肾脏疾病和抑郁类疾病等诸多疾病的发生。作为人体内最庞大、最复杂的微生态系统，肠道微生物不仅能调节营养物质代谢，其代谢产物，即短链脂肪酸，还在膳食和宿主健康之间起到重要的纽带作用，近年来受到了广泛关注。

短链脂肪酸又称挥发性有机酸，是碳链为1～6的有机脂肪酸，按碳数多少可分为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，而生物体内的短链脂肪酸主要为乙酸、丙酸和丁酸，约占短链脂肪酸总量的90％～95％，由碳水化合物经肠道细菌降解生成，其余短链脂肪酸只占很小部分(约为5％～10％)，其中异丁酸和异戊酸等支链短链脂肪酸来源于蛋白质的分解。短链脂肪酸是肠腔内重要的有机酸阴离子，通过离子或非离子形式被结肠粘膜吸收，是结肠和小肠上皮细胞的主要供能物质。研究发现，短链脂肪酸可以促进钠离子吸收，维持肠上皮细胞的内外渗透压，促进结肠细胞增殖和粘膜生长，提供代谢能源，增加肠道血流，刺激胃肠激素生成，是结肠粘膜的重要营养素。此外，某些短链脂肪酸对肠道黏膜和固有层的免疫细胞也有重要调控效应，其对于维持肠道正常生理功能和肠上皮细胞形态、功能等具有极其重要的作用。

短链脂肪酸含量可以反映体内菌群的活性和机体整体的健康状况，通过测定肠道内容物或粪便中短链脂肪酸含量水平可以整体诊断体内厌氧菌的变化，成为评价和帮助判断多种慢性疾病的初筛指标之一，研究发现，短链脂肪酸合成的减少与多种疾病的产生有关，例如，溃疡性结肠炎症、克罗恩病、风湿性关节炎和过敏等疾病。因此，建立一种简单、高效和准确测定肠道内容物或粪便中短链脂肪酸的方法，对于在大量样本中进行慢性疾病(如炎症性肠病)的筛查，显得尤为重要。目前测定短链脂肪酸的方法主要有气相色谱质谱联用法、气相色谱法、离子色谱法和液相色谱法，但是之前的这些方法均存在一定缺点。气相色谱质谱联用法仪器成本较高，而且数据结果处理比较繁琐；之前的气相色谱法和液相色谱法，或者是涉及到短链脂肪酸的衍生化步骤，或者是前处理温度较高，这些均导致了样品中短链脂肪酸的挥发损失，造成测定结果不准确。

王彩等人(王彩,高培鑫,许竞男,et al.小鼠粪便中短链脂肪酸提取与检测方法的建立及应用[J].现代生物医学进展,2017(06):21-24.)建立了采用高效液相色谱法测定粪便中短链脂肪酸的方法，其同样直接采用乙醚萃取短链脂肪酸，采用等度洗脱程序(磷酸和乙腈作为流动相)进行测定目标物，但是其处理过程在室温完成，并涉及到用氢氧化钠水溶液中和和萃取的短链脂肪酸这一过程，因而，前处理时间较长，造成短链脂肪酸损失，导致加标回收率范围偏大(86.6％～105.8％)。此外，液相洗脱程序超过25min，而且仅测定出乙酸、丁酸和异戊酸三种目标产物。