[发明专利]一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS

权利要求书

1.一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS，其特征在于，该方法用于棉花发芽及幼苗阶段基因沉默，包括如下步骤：

（一）制备转染用菌液

针对待沉默的目的基因，通过病毒质粒介导转化农杆菌菌株GV3101，制备转染用菌液；

所述待沉默的目的基因为陆地棉GhHLS1基因或GhCLA1基因；

（二）利用烟草进行扩增

将步骤（一）中的转染用菌液接种烟草叶片，并进行培养，收集含病毒粒子的烟草叶片并制备成病毒侵染液；

（三）侵染棉花种子

将脱绒棉花种子浸泡萌发后，用步骤（一）中转染菌液在22~24℃条件下，避光浸泡培养1 d；然后移到潮湿蛭石培养3 d；或用步骤（二）中病毒侵染液在22~24℃条件下，避光浸泡培养3 d；然后移到潮湿蛭石培养共培养5~7 d。

2.如权利要求1所述棉花发芽及幼苗阶段的基因沉默方法Si-VIGS，其特征在于，步骤（二）中，所述烟草，为本氏烟草或普通烟草品种。

3.如权利要求1所述棉花发芽及幼苗阶段的基因沉默方法Si-VIGS，其特征在于，针对待沉默的目的基因为陆地棉GhHLS1基因或GhCLA1基因，具体步骤为：

（一）制备转染用菌液

（1）提取棉花叶片RNA，并反转录为cDNA备用；

（2）设计引物，PCR扩增棉花，并回收扩增产物；

扩增GhHLS1时，引物序列设计为：

GhHLS1-F：5'-GGAATTCCGTTGGTCCCAGTAGCG-3'，

GhHLS1-R：5'-GGGTACCCGGACGGCGTACGGAAC-3；

扩增GhCLA1时，引物序列设计为：

GhCLA1-F：5'-ACTAAAACAACGGGTCCGGTCTTGAT-3'，

GhCLA1-R：5'-AGGTTTCAAGCCTTCACAGGCCAA-3'；

（3）酶切、连接、并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得pTRV2-GhHLS1、pTRV2-GhCLA1；

（4）将步骤（3）中pTRV2-GhHLS1、pTRV2-GhCLA1进一步转化农杆菌菌株GV3101，制备转染用菌液；

（二）利用烟草进行扩增

利用注射器，通过烟草叶片上的伤口缓慢注入步骤（一）中的转染用菌液，并继续培养7d；

收集含病毒粒子的烟草叶片，将叶片剪碎后加入磷酸缓冲液，研磨成液体匀浆，过滤备用；

（三）侵染棉花种子

将脱绒棉花种子浸泡萌发后，用步骤（一）中转染菌液在22~24℃条件下，避光浸泡培养1 d；然后移到潮湿蛭石培养3 d；或用步骤（二）中病毒侵染液在22~24℃条件下，避光浸泡培养3 d；然后移到潮湿蛭石培养共培养5~7 d；具体而言：

培养过程中，保持湿度60-70%，温度22-24℃；针对种子发芽过程基因沉默，移到潮湿蛭石后培养3 d；针对种子幼苗发育过程基因沉默，培养棉花种子长到两片子叶完全展开后，移至正常条件下培养。