[发明专利]一种以铁蛋白为载体肿瘤纳米探针的制备方法

说明书

本发明公开一种以铁蛋白为载体制备具有肿瘤靶向作用荧光探针的方法，所述铁蛋白载体包含人重链铁蛋白。将笼状结构的人重链铁蛋白解聚为单体状态；向解聚的人重链铁蛋白中加入具有荧光性质的香豆素‑6使其与铁蛋白结合；将结合有香豆素‑6的所述解聚人重链铁蛋白重新聚合为纳米颗粒。本发明所制备的纳米探针具有生物相容性好，可特异性地在过表达转铁蛋白受体1(TfR1)的肿瘤细胞表面富集，利用香豆素‑6的荧光特性为给药系统的体内示踪提供一种高效的检测方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有靶向肿瘤细胞的荧光探针的制备方法，通过在铁蛋白内部装载荧光染料香豆素-6制备具有肿瘤靶向的荧光探针，用于肿瘤细胞或活体的肿瘤靶向荧光成像等检测。

背景技术

为了实现药物的高效利用和体内示踪，并且减少其对人体各个组织的副作用伤害，荧光标记法以追踪药物的吸收和运转情况已成为一种重要的方法。研究者们希望能够找到合适的载体和合适的控释方法，使其在特定时间、特定地点进行释放。不但要求载体有良好的靶向性，还要求其有良好的生物相容性，以及较大的载物量。以无机非金属纳米探针、金属纳米探针、高分子材料、脂质体、生物膜等作为载体的纳米给药系统，能够有效穿透脑屏障、网状内皮组织等，但这些载体靶向性差，为了提高载体的靶向性，最常见的方法是通过共价化学修饰，将靶向分子与载体骨架相结合，制备一种具有靶向的纳米药物给药系统。但化学修饰相对复杂，易灭活包载物和破坏纳米药物给药系统。包载物的释放方法则常常使用温度、磁场、光、pH、特定分子、受体、特异性蛋白等刺激信号使药物定向释放。

铁蛋白(ferritin)，普遍存在于生物体内的一种高效贮铁蛋白质，是蛋白质笼纳米载体中非常重要的一种，它是由24个亚基自组装形成的八面体高度对称的笼状空间结构，外径约12nm，内径约8nm。人重链铁蛋白(HFtn)作为理想的肿瘤治疗药物载体，其具有诸多天然优势，如水溶性和稳定性好，在人体中自然存在，尺寸均一，与肿瘤表面过表达的转铁蛋白受体(TfR1)特异性结合。TfR1在大部分恶性肿瘤中都高度表达，包括乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤等，因此HFtn具有广泛的肿瘤细胞识别能力。

香豆素-6(Coumarin-6，COU)常常被用做荧光染料。它是一种量子产率高、细胞穿透性好、性能比较稳定的脂溶性荧光染料，但由于香豆素-6的溶解性极差，几乎不溶于水，使其应用受到一定的局限。因此，将其包埋于可溶性的纳米载体是提高其应用范围的一条有效途径。

因此，以铁蛋白作为载体包裹香豆素-6所制备的荧光探针，不仅能在富含TfR1受体的肿瘤细胞表面富集，且能通过荧光信号检测靶向效果，应用于靶向给药的体内示踪。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种靶向肿瘤的纳米荧光探针的制备方法。为了实现药物的高效利用和体内示踪，以铁蛋白为载体，装载香豆素-6荧光染料，铁蛋白-香豆素-6(HFtn-COU)荧光探针能够富集在TfR1高表达的肿瘤细胞表面，用于纳米载药系统的体内示踪。

技术方案：为实现上述目的，本发明所述的以铁蛋白为载体装载香豆素-6的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：铁蛋白的获得；将香豆素-6装载于铁蛋白中；对装载后的铁蛋白与香豆素-6的混合溶液进行透析和浓缩。

其中，所述铁蛋白来源于大肠杆菌。

所述制备方法具体包括以下步骤：

(1)铁蛋白的分离纯化方法为：将表达目的蛋白的大肠杆菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃恒温下、210r/min振荡培养，OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达，将菌液8000r/min离心5min后收集菌体，将收集的菌体溶于裂解缓冲液进行重悬。将悬液以5s为间隔破碎15min后，8000r/min离心5min收集上清，将上清水浴热处理后再次离心，利用亲和层析法洗脱后得到粗样品铁蛋白，使用体积排阻色谱纯化得到铁蛋白溶液。