[发明专利]一种青霉素G酰化酶的共交联固定化方法

说明书

本发明是关于一种青霉素G酰化酶的共交联固定化方法。使用油溶性的丁二醇双丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的青霉素G酰化酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化青霉素G酰化酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在37mg酶/g载体时其相对活性达到游离酶的91％。

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种青霉素G酰化酶的共交联固定化方法，该新型固定化青霉素G酰化酶可专门用于多种反应的特异性催化剂。

背景技术

青霉素G酰化酶(EC 3.5.1.11)又名青霉素氨基水解酶，属于氨基水解酶类，可以特异性地将酰胺健水解，是一种重要的工业用酶。青霉素G酰化酶属于分子量较大的球蛋白，其三维结构由含有催化位点的大亚基和含有侧链结合位点的小亚基(通过氢键结合而成。该酶等电点约在6.5～6.7。青霉素G酰化酶由α、β两个亚基组成，α或β亚基单独存在时均不具有酶活性，当二者通过氢键结合以后才有活性。α亚基可与青霉素G的侧链发生特异性结合，从而决定酶的底物专一性；β亚基含有催化位点和与催化有关的残基-丝氨酸残基，因而青霉素酰化酶与丝氨酸蛋白酶有相似之处，均可通过丝氨酸残基来催化反应。青霉素G酰化酶也是一种多功能酶，具有广泛的底物谱、高区域选择性、化学选择性和对映体选择性，能够催化多种反应。青霉素G酰化酶在手性化学品合成中应用广泛，主要可以分为6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)的制备、β内酰胺抗生素的合成。此外，作为生物催化剂的青霉素酰化酶在很多反应中有潜在的价值，如在肽的合成过程中用于保护氨基和羟基，以及用于拆分手性化合物的外消旋混合物等，具有反应速度快、条件温和、对环境的污染小等优势。手性化合物的拆分、前手性化合物的不对称水解和多肽合成5个方面。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的青霉素G酰化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的青霉素G酰化酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的青霉素G酰化酶的储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于青霉素G酰化酶的固定，利用青霉素G酰化酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种青霉素G酰化酶的固定化方法，这种方法是基于青霉素G酰化酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂丁二醇双丙烯酸酯，水相中的反应物为青霉素G酰化酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过青霉素G酰化酶的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联；