[发明专利]一种氯过氧化物酶的共交联固定化方法

说明书

本发明是关于一种氯过氧化物酶的共交联固定化方法。使用油溶性的异氰脲酸三丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的氯过氧化物酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化氯过氧化物酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在66mg酶/g载体时具有最高的比活性，达到游离酶的91％。

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种氯过氧化物酶的共交联固定化方法，该新型固定化氯过氧化物酶可专门用于有机化合物的高效制备。

背景技术

氯过氧化物酶(EC 1.11.1.10)，是由Hager等人首次于上世纪60年代从海洋真菌中分离出来的一种血红素糖蛋白酶(等电点为3.5)。在过氧化物酶家族中，它是应用最广泛的酶之一，并且兼具过氧化物酶、过氧化氧酶和细胞色素的催化活性。纯的氯过氧化物酶呈红褐色，其分子量大约42kDa，呈酸性，由299个氨基酸组成，其中含有9个α-螺旋和2个β-折叠。，α-螺旋和β-折叠分别占整个氨基酸总量的34％和1.34％。氯过氧化物酶大约含20％～30％的糖类化合物，还有大约30％的非蛋白成分。

氯过氧化物酶是用H₂O₂等过氧化物作电子受体，催化各类底物发生氧化反应。氯过氧化物酶因其独特的活性位点结构而具有多种催化性能，在生物转化方面具有高选择性，高催化活性，常温下使用等特点。同时氯过氧化物酶具有广泛的催化性能，它能催化杂原子氧化(S-氧化和N-氧化)、环氧化、碳氢键氧化、醇氧化和吲哚氧化；引人关注的是氯过氧化物酶对烯烃的卤化、环氧化、羟基化和有机硫化合物的磺化氧化等反应的催化作用。又因底物适应性广泛和较高的立体选择性，它已逐渐成为有机合成、制药工业和工业催化中极具前景的绿色催化剂。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的氯过氧化物酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的氯过氧化物酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的氯过氧化物酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于氯过氧化物酶的固定，利用氯过氧化物酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种氯过氧化物酶的固定化方法，这种方法是基于氯过氧化物酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂异氰脲酸三丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为氯过氧化物酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过氯过氧化物酶的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联，同时交联剂含有多个双键，使交联产物形成支化结构，更大限度地阻止酶的聚集，增强酶的活力；