[发明专利]一种过氧化氢酶的共交联固定化方法

说明书

本发明是关于一种过氧化氢酶的共交联固定化方法。使用油溶性的双季戊四醇六丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的过氧化氢酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化过氧化氢酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在88mg酶/g载体时具有最高的活性，达到游离酶的90％。

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种过氧化氢酶的共交联固定化方法，该新型固定化过氧化氢酶可专门用于处理工业废水。

背景技术

过氧化氢酶(EC 4.2.1.84)，又称触酶(等电点为6.5)，是一种广泛存在于动、植物以及微生物体内的氧化还原酶。作为一种单一酶类，过氧化氢酶是在1811年被过氧化氧的发现者首次发现。过氧化氢酶的活性中心为铁卟啉环，每一蛋白分子中含有四个铁原子，相对分子量一般为200～340kDa。过氧化氢酶以H₂O₂为专一底物，通过催化转移一对电子使之分解为H₂O和O₂。过氧化氢酶是生物防御系统的关键酶之一，作为生物体内的重要物质，其主要的作用就是参与活性氧的代谢。

根据过氧化氢酶分解H₂O₂放出O₂的性质，人们将过氧化氢与过氧化氢酶作为疏松剂用于食品的烘烤过程。除此之外，过氧化氢酶在食品工业中更多的是应用于乳制品的消毒，即在牛奶保存和奶酪制造前用过氧化氢对牛乳和干酪原料乳进行杀菌消毒，牛乳和原料乳中残留的过氧化氢则通过过氧化氢酶去除。这种消毒工艺可以在低温下进行，避免了高温处理时蛋白质变性及营养物质的流失。在造纸工业中，由于传统含氯漂白剂与残留木素反应会形成有毒污染物，近年来双氧水漂白技术逐渐取代了传统漂白剂，而残留过氧化氢的去除也成了一个重要问题。过氧化氢酶对漂白后的双氧水有着高效的降解作用。在环保行业中，经常利用双氧水配合过氧化氢酶来处理工业废水，可迅速降解芳环及脂肪族的化合物；而将双氧水配合过氧化氢酶应用于生物过滤器时还可在一定程度上改善过滤器对废水的脱臭效果。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的过氧化氢酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的过氧化氢酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的过氧化氢酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于过氧化氢酶的固定，利用过氧化氢酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种过氧化氢酶的固定化方法，这种方法是基于过氧化氢酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂双季戊四醇六丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为过氧化氢酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过过氧化氢酶的浓度来调节。