[发明专利]一种单宁酶的共交联固定化方法

说明书

本发明是关于一种单宁酶的共交联固定化方法。使用油溶性的三羟甲基丙烷三丙烯酸酯作为交联剂，水相中的反应物为含有氨基的单宁酶以及胺化环氧树脂与β‑环糊精形成的超分子复合物，利用双键与氨基的迈克尔加成反应，在较低的温度下发生共交联聚合反应，制备出不同负载量的固定化单宁酶。通过控制交联程度，提高分散性，改善其内部的传质微环境，该固定化酶具有较高的催化活性，负载量在89mg酶/g载体时具有最高的活性，达到游离酶的92％。

技术领域

本发明涉及固定化酶生物催化技术领域，尤其是一种单宁酶的共交联固定化方法，该新型固定化单宁酶可专门用于去除天然食品中由于单宁物质所造成的苦涩味。

背景技术

单宁酶(EC 3.1.1.20)又称为单宁酰基水解酶(等电点为4.5)，是一种由微生物在单宁存在的条件下诱导而产生的细胞膜结合酶。单宁酶来源丰富，不仅广泛存在于自然界中富含单宁的植物体内，还存在于大量的单宁酶产生菌中。单宁酶分子量在50～320kDa之间，其四级结构是由两个或两个以上不同亚基通过二硫键形成的异六聚体或异八聚体。纯单宁酶为白色或淡黑色粉末，不溶于乙醇，能溶于水形成无色澄清溶液。该酶能催化单宁和没食子酸酯类中的酯键和缩酚键的水解，生成没食子酸和相应的醇类，不同来源的单宁酶酶学性质有所差异。

单宁酶在化工、制药、食品、饲料、皮革、化妆品等领域均得到了广泛的应用。单宁酶在皮革生产过程中促使生皮鞣化过程更加均匀，有利于高级皮革的制造。许多植物饲料经常含有一些单宁，这些单宁能够与家畜的消化蛋白酶或者植物蛋白质发生反应凝固沉淀，降低家畜对蛋白质的吸收效率。使用单宁酶处理后的饲料会提高家畜对饲料中营养物质的吸收率。在化妆品生产中，许多公司为了使化妆品具有滋养、祛斑、防晒等功效，经常会在配方中加入植物提取液，当植物提取物中含有单宁时会出现化妆品浑浊、结块现象。单宁酶处理则可以解决这一问题。单宁酶在食品加工工业中可用于去除天然食品中由于单宁物质所造成的苦涩味。

固定化酶就是通过化学手段将水溶性的游离酶变成不溶性的固体酶，固定化有很多优点：例如固定化的单宁酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低；固定化的单宁酶极易与反应体系分离，简化了操作工艺；固定化的单宁酶其储存稳定性和热稳定性都得到了提高；固定化酶的催化反应过程更易控制；固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。酶的交联是一种非常有效的固定化方法，其所形成的产物称为交联酶聚集体。最常用的交联剂为水溶性的戊二醛，它反应活性高，用量难以控制，很容易造成酶的过度交联，使酶的活性有很大的损失，此外，传统的交联法往往须要在交联之前使酶分子沉淀聚集，这样既会造成酶的浪费，又会阻断传质通道，无法充分发挥酶的催化效率。

本发明专利提供一种共交联的方法用于单宁酶的固定，利用单宁酶分子上的氨基与丙烯酸酯类交联剂发生迈克尔加成反应，同时还引入含有β-环糊精的结构单元，这样既能为催化反应提供空间，降低传质阻力，同时还能增加亲水性，提高酶的活性。使用这种共交联方法，酶的负载量和催化活性高，稳定性好，固定化酶呈颗粒状，催化反应容易操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种单宁酶的固定化方法，这种方法是基于单宁酶与另一种含有机胺的分子复合物的共交联反应，交联反应的基础是丙烯酸酯与氨基的迈克尔加成，该反应在常温下就能快速发生，因而不会对酶的整体结构造成破坏，共交联法负载效率高，稳定性好，同时还能调节固定化酶的微环境，使其保持高的催化活性。

1、本发明解决技术问题所采用的技术方案为：一种水/油两相的交联反应，油相为交联剂三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，其结构如图1所示，水相中的反应物为单宁酶及β-环糊精与胺化环氧树脂的超分子复合物，固定化酶的负载量是通过单宁酶的浓度来调节。

非常有益的是，通过多相反应可以控制交联程度，避免酶的过度交联，同时交联剂含有多个双键，使交联产物形成支化结构，更大限度地阻止酶的聚集，增强酶的活力；