[发明专利]一种3D DNA行走机器耦合催化发夹自组装的microRNA生物传感器

权利要求书

1.一种简便的、熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应用于microRNA检测的生物传感器，其制备方法包括以下步骤：

(1)、3-D DNA行走机器的制备

将纯化后的三条核酸链LS、AS、S和TEMg缓冲液经退火后重新折叠以制备LS/AS/S三核酸复合物(C3)。LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。退火过程是将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。接着将链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球(PS)50μL以12000转离心5分钟，用binding buffer洗涤2次后离心弃去上清液。再用50μL binding buffer重悬浮后加入5μLμM C3。在37℃恒温箱孵育15分钟后，用TEMg缓冲液洗涤3次，12000转离心5分钟弃去上清。最后再用50μL的TEMg缓冲液重悬浮，最后DNA功能化的3-D DNA行走机器(C3/PS)制备完成。

(2)、信号探针的制备

将发夹探针(H1)和发夹探针(H2)退火后重新折叠。将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。将标记了FAM的信号探针RepF，标记了BHQ1的信号探针RepQ以1∶2的比例在1×TNaK缓冲液中杂交。

(3)、MicroRNA的检测

将5μL C3/PS复合物，2μL 10μM燃料核酸(FS)，33μL cutsmart缓冲液，和10μL不同浓度的目标物在37℃恒温箱孵育60分钟。然后离心分离取40μL的上层清液添加到含有5μL 1μMH1，2μL 10μM H2，10μL 50nM RepF：RepQ复合物和23μL 1×TNaK缓冲液中，在室温下避光反应60分钟。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。

2.如权利要求1所述的熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应的生物传感器，其制备方法步骤(1)中LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。

3.如权利要求1所述的熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应的生物传感器，其制备方法步骤(2)中RepF和RepQ的比例是1∶2。

4.如权利要求1所述的熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应的生物传感器，其制备方法步骤(3)中熵驱动是在37℃恒温箱孵育60分钟。

5.如权利要求1所述的熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应的生物传感器其制备方法步骤(3)中在室温下避光反应60分钟。