[发明专利]PCR反应增强剂组合物、微滴式逆转录数字PCR反应液及应用

说明书

本发明提供一种PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中任意一种。本发明还提供一种微滴式逆转录数字PCR反应液，其特征在于，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中任一种；优选地，所述PCR反应液包含0.05～1mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白、0.1～2mol/L海藻糖、0.02～1％w/v诺纳德P‑40。本发明还涉及包含所述PCR反应液的试剂盒以及利用所述PCR反应液进行微滴式逆转录数字PCR的方法。利用本发明提供的PCR反应液能提高阳性微滴逆转录PCR扩增效率，减少假阴性的产生，有利于核酸靶分子的精准定量分析。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种微滴式逆转录数字PCR反应液及其应用。

背景技术

微滴式逆转录数字PCR(reverse transcription droplet digital polymerasechain reaction，RT-ddPCR)是一种对目标核糖核酸(RNA)进行绝对定量的方法。相较于定量RT-PCR(quantitative RT-PCR，qRT-PCR)，其在精密度、准确度和灵敏度方面具有无与伦比的优势；同时，RT-ddPCR消除了对定量标准曲线的依赖，并提高了对扩增抑制物的耐受能力。

RT-ddPCR的工作原理是在RT-PCR扩增前对反应液进行微滴化处理，即将含有模板RNA的反应液分散成数万个纳升级的微滴，每个微滴不含或含有一至数个模板RNA，且每个微滴都作为一个独立的RT-PCR反应单元。经RT-PCR扩增后，含有模板RNA的微滴产生荧光信号，不含模板RNA的微滴不产生荧光信号。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出模板RNA的起始浓度或拷贝数。

纳升级微滴是RT-ddPCR的基本反应单元。微滴体积的减小增大了其比表面积，有助于RT-PCR扩增过程中热量的快速传导。然而，纳升级微滴的界面效应显著增强，导致疏水的逆转录酶和DNA聚合酶倾向于吸附在油水界面，并可能在油水界面发生蛋白质变性(Williams R.et al.Amplification of complex gene libraries by emulsionPCR.Nature methods，2006，3(7):545-550)。逆转录酶和DNA聚合酶的界面吸附作用降低了RT-ddPCR的扩增效率，导致含有模板RNA的微滴不产生荧光信号，使核酸靶分子的绝对定量出现错误。因此需要一种优化的PCR反应液，消除逆转录酶和DNA聚合酶在油水界面的吸附作用。

发明内容

为解决上述逆转录酶和DNA聚合酶在油水界面的吸附问题，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种。

优选地，本发明的PCR反应增强剂组合物，其包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。

较优选地，本发明的PCR反应增强剂组合物，其由T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40构成。

本发明提供一种微滴式逆转录数字PCR反应液，其中，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种。

优选地，本发明的微滴式数字PCR反应液中的PCR反应增强剂组合物包含T4噬菌体基因32编码蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。

优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.05～1mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白。

较优选地，本发明的微滴式逆转录数字PCR反应液，其包含0.05～0.5mg/mL T4噬菌体基因32编码蛋白。