[发明专利]用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针及其应用

说明书

本发明公开了一种艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV‑1病毒RNA的pol基因的第41位、67位、70位、210位、215位和151位突变位点M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M的ARMS引物和Taqman探针。本发明还提供了上述引物对和探针在检测D4T和AZT主要耐药突变位点M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M中的应用。本发明试剂盒检测灵敏度高、特异性好、检测成本低，为临床艾滋病患者治疗提供了用药指导，实现了艾滋病患者个体化治疗，能够提高药物有效果性，改善患者的生存质量，具有广泛应用前景和社会效益。

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针及其应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(HIV-1),属于逆转录病毒慢性病毒，是艾滋病的病原体。艾滋病即获得性免疫缺陷综合症(AIDS),是一种由人类免疫缺陷病毒引起的，以全身免疫系统严重损伤为特征的传染性人体免疫系统疾病。临床表现为不常见的感染、恶性肿瘤以及不明原因的免疫缺陷综合症。

HIV-1的病毒结构、生活周期及复制过程：

HIV-1是RNA逆转录病毒，它的生活周期类似于RNA肿瘤病毒。病毒颗粒外包被磷脂双分子层包膜，内有圆柱状核心蛋白，有RNA逆转录酶、整合酶和结构蛋白等组成。有三个蛋白基因：gag基因编码核心蛋白、pol基因编码逆转录酶与整合酶、env基因编码包膜蛋白；6个非结构蛋白基因。HIV-1病毒颗粒从亲代到子代的复制过程，构成了它的生活周期，包括了病毒的衣服、侵入和脱壳、反转录、整合、病毒RNA和蛋白质的合成、装配、释放和成熟等阶段。首先HIV-1通过与宿主细胞上的受体结合，与宿主细胞膜融合后侵入靶细胞。一旦HIV-1外壳和靶细胞质膜相融合，病毒的核心蛋白就进入细胞。在HIV-1的核心蛋白中包埋着RNA基因组合逆转录酶。病毒的RNA基因组复制需要经过DNA中间产物，后在逆转录酶的作用下将病毒RNA基因组转变成双链DNA，再整合进入宿主细胞的染色体中，最后以原病毒的形式成为宿主基因组的永久成分，并在宿主细胞分裂时随宿主DNA的复制而复制。

科学家发现了的HIV-1的治疗药物司他夫定(D4T)和齐多夫定(AZT)是目前常用的两种HIV-1核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTIs),但是由于耐药突变的产生大大降低了这两种药物的有效性。过去的研究一证明可引起D4T和AZT耐药产生的突变是pol结构基因M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M六中突变。

目前应用于检测HIV-1耐药突变的方法主要是PCR产物直接测序法。然而该方法却存在着检测周期长、灵敏度低、非闭管操作、易造成交叉污染、杂合突变等等缺陷，使得很难适应于临床检测。因此，开发出一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的HIV-1耐药突变检测方法是对临床检测HIV-1耐药检测具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的方法存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本发明提供了一种灵敏度高、特异性好、检测成本低、快速、简单的艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，还提供了一种包括上述引物对和探针的检测试剂盒以及使用方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，如下：

本发明提供了一种艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第41位、67位、70位、210位、215位和151位突变位点M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M的ARMS引物和Taqman探针。