[发明专利]一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法及应用。利用缺失非结构蛋白NS1基因的西尼罗病毒克隆通过NS1细胞系反式互补拯救产生的WNV‑ΔNS1复制缺陷病毒，与野生型WNV病毒生长趋势相似、免疫原性相同，遗传稳定性高，只能在筛选出的表达WNV NS1的细胞系中复制和扩增，可以在生物安全二级实验室进行该病毒的疫苗相关研究。该病毒可以作为一种安全高效的候选疫苗预防WNV病毒感染，对我国应对WNV的潜在威胁具有良好的应用前景和重要的战略意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复制缺陷西尼罗病毒的制备方法及应用。

背景技术

西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)属于黄病毒科黄病毒属，同属其他病毒包括登革热病毒(DENV)，黄热病病毒(YFV)，寨卡病毒(ZIKV)等。WNV在自然界中的传播循环为鸟-蚊-鸟，鸟是该病毒的贮存宿主，蚊虫为主要传播媒介，人和马可作为该病毒的偶然宿主。人感染WNV后可导致西尼罗热，并可继发为致死性脑炎、脑脊膜炎等中枢神经系统疾病。WNV最早于1937年的乌干达西尼罗地区被发现，起初仅在小范围传播，并没有引起严重的疾病，直至1999年在美国纽约暴发流行后，迅速传播至美洲大陆，引发了严重的公共卫生问题。WNV除了给人类健康带来威胁外，在北美等地也导致了大量的马匹、鸟类等家禽及野生鸟禽的感染及死亡，给养殖业和生态造成了严重影响。

WNV病毒属于生物安全三级病毒，需要在生物安全三级实验室进行活病毒的操作，极大地限制了对该病毒的研究。疫苗是预防WNV感染的有效手段，目前还没有批准上市的人用WNV疫苗。WNV疫苗的研究主要集中在灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗。减毒活疫苗因免疫原性强，可引起体液和细胞免疫应答，诱导较全面而持久的免疫保护，在WNV疫苗研发中受到重视。然而该类疫苗存在毒力回复的隐患，而安全性是人用疫苗关注重点，特别是对于生物安全等级较高的三级病原应当更加重视。

WNV基因组为单股正链RNA，长度约11kb。整个基因组包括5’非编码区(Non-CodingRegion，NCR)、3’非编码区以及一个开放阅读框架(Open Reading Frame,ORF)。开放阅读框编码一个多聚前体蛋白，在病毒和宿主蛋白酶作用下可被切割成3种结构蛋白：衣壳蛋白(Capsid protein；C)、膜蛋白(Membrane protein；M)和包膜蛋白(Envelope protein；E)以及7种非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白在病毒颗粒组装成熟中发挥着重要作用，非结构蛋白主要参与病毒基因组的复制和免疫逃逸。非结构蛋白NS1是一种高度保守的多功能糖蛋白，大小约40kD，参与病毒早期复制，并与NS4A、NS4B等蛋白存在相互作用。WNV NS1蛋白对病毒免疫应答和复制非常重要，前期的研究表明WNV NS1可与RIG-I和MDA5相互作用，从而抑制β-干扰素的产生；NS1基因突变后可影响病毒的复制，而这种复制降低可通过提供野生型的NS1来反式互补回复；YFV的NS1基因大片段缺失后病毒不能复制，通过反式提供NS1蛋白可有效互补NS1的复制缺陷，获得复制缺陷病毒。复制缺陷病毒因与野生型病毒生长相似、免疫原性相同，只能在筛选出的表达缺失基因的细胞系中复制和扩增，具有作为一种安全疫苗的潜力，近年来被广泛应用于高等级生物安全病原的疫苗研发中。