[发明专利]一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了提供一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法及其应用，由此制备抗白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体，用于检测白色念珠菌烯醇化酶蛋白。配对的单克隆抗体可特异性的与白色念珠菌烯醇化酶蛋白反应，与其它主要的念珠菌病原烯醇化酶无交叉反应，因此可以应用于白色念珠菌的鉴定。配对的单克隆抗体可以扩展应用至其他基于抗原抗体反应的免疫学检测技术，包括免疫层析胶体金、化学发光定量检测等，与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有稳定性好、易于标准化的优点，更适合用来建立商品化的标准检测方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备及其应用。

背景技术

念珠菌为条件致病性真菌，正常情况下可定植于宿主的皮肤、口腔、上呼吸道、阴道和肠道等部位，不引起疾病。当某些因素如广谱抗生素大量使用、放疗与化疗、免疫抑制剂使用等破坏了宿主免疫系统与念珠菌之间的平衡，念珠菌可侵入组织、血液并生长繁殖，导致宿主的组织损害、器官功能障碍和炎症反应等病理改变，此类感染为侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)，致病菌多为白色念珠菌。

临床实验对白色念珠菌的鉴定主要依赖于传统的微生物培养，该方法阳性率低且耗时较长，已不适应现代医学发展的需要。(1,3)-β-D葡聚糖实验又称G实验，目前已在临床上逐渐得到应用，该方法利用真菌细胞壁组分(1,3)-β-D葡聚糖可以激活鲎变形细胞溶解产物G因子的原理诊断真菌感染，其检测效能已经得到多数实验室的肯定。然而，G实验仍有较明显的缺陷，如较高的假阳性率，不能明确真菌的种属，检测极易受致热原的影响等等。

烯醇化酶(enolase，eno1)又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶，它催化磷酸甘油向磷酸烯醇式丙酮酸转化，是白色念珠菌糖酵解过程的限速酶。一直以来认为该酶是一个古老的、保守的、功能单一的蛋白，然而随着分子生物学对有免疫原性蛋白的研究日趋发展，发现该酶是白色念珠菌血清学检测最重要的靶标分子，例如，侵袭性念珠菌感染患者可以观测到烯醇化酶血症。目前，据国内胡毓安等报道，利用抗烯醇化酶单克隆抗体与羊抗烯醇化酶多克隆抗体匹配，建立ELISA方法可检测白色念珠菌培养上清中的烯醇化酶蛋白，该方法与近平滑念珠菌有微弱的交叉反应，与热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应。

上述检测过程采用单克隆-多克隆抗体匹配检测烯醇化酶，根据发明人所进行的资料检索，国内外尚无采用一对单克隆抗体进行白色念珠菌烯醇化酶蛋白的报道。

发明内容

为了探讨单克隆抗体检测白色念珠菌烯醇化酶蛋白在白色念珠菌的鉴定中的敏感性和特异性，本发明做了大量临床试验。结果表明，烯醇化酶可以作为白色念珠菌的检测指标，用于鉴定白色念珠菌。

本发明的目的在于，提供一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法，主要包括如下步骤：

1)切胶法制备白色念珠菌免疫原

以液氮研磨法制备白色念珠菌全菌蛋白，制备得到的白色念珠菌全株蛋白采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PADE)后切取分子量大小约为48kD的胶条，胶条中的蛋白经电洗脱后以二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度；

2)动物免疫

取上述制备得到的蛋白溶液注射免疫小鼠，首次基础免疫取步骤1)制备的蛋白液(主要为烯醇化酶)0.4ml(1mg/ml)与等量弗氏完全佐剂充分混合乳化，采用腹腔注射免疫BALb/C小鼠两只，每只小鼠0.2ml(蛋白量200μg)；两周后，用弗氏不完全佐剂0.2ml与等量蛋白液充分混合乳化，腹腔注射两只小鼠进行第二次免疫，每只小鼠0.1ml(蛋白量100μg)；免疫5天后，以间接ELISA法分别测定两只小鼠抗体效价；第三次免疫(加强免疫)不用佐剂，采用0.1ml蛋白液(100μg)脾内注射免疫抗体效价较高的小鼠；免疫三次以后测定小鼠血清效价，效价达1:100000以上时供融合使用，如效价达不到上述指标，则增加一次加强免疫；