[发明专利]一种荧光探针分子ML-FP及其制备方法和应用

说明书

本发明公开的荧光探针分子ML‑FP包含绿色荧光蛋白‑磺酸酯结构及吗啉溶酶体定位基。本发明还公开荧光探针分子ML‑FP的制备方法和应用。该荧光分子可以作为溶酶体定位活性硫醇荧光探针。该荧光探针由吗啉吲哚荧光蛋白衍生物与2,4‑二硝基苯磺酰氯反应制得的荧光分子，通过生物硫醇选择性诱导的芳香亲核取代反应脱去其芳基磺酸酯结构可打开荧光开关，对半胱氨酸及谷胱甘肽能够实现选择性识别，该荧光探针分子抗背景干扰能力强，灵敏度高，细胞毒性小，生物相容性好，能快速进入溶酶体，可作为性能优异的溶酶体定位活性硫醇荧光探针，在荧光成像、生物荧光分析、药物研发、荧光标记、内源性或外源性活性硫醇检测方面具有广泛应用。

技术领域

本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种荧光探针分子ML-FP及其制备方法和应用，尤其涉及溶酶体定位绿色荧光蛋白类活性硫醇荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

生物硫醇小分子例如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(GSH)在生命体中发挥着重要作用，参与了许多人体生理平衡以及代谢过程，维持着人体的正常生理功能。这些活性硫醇小分子在体内的含量水平变化与生理健康有着密切联系。例如半胱氨酸(Cys)，它不仅是谷胱甘肽、乙酰辅酶和牛磺酸的前体，也是体内硫铁络合物中硫配体的提供者，它还可以减弱身体对铜的吸收能力提高整个代谢系统的解毒功能；还原型谷胱甘肽(GSH)可以消除人体自由基，提高人体免疫力抗衰老等；同型半胱氨酸(Hcy)也在细胞的还原和肝脏内的磷脂代谢过程中发挥着重要作用，保护肝细胞不受损害并维持肝功能。但是如果这些含硫生物小分子在体内的含量失衡会导致各种疾病的产生如神经退行性疾病、心脑血管疾病以及癌症等。因此检测生物体内活性硫醇具有极为重要的意义。目前采用最为广泛的检测活性硫醇的方法是荧光探针法。制备性能优异的活性硫醇荧光探针是近期的研究热点。

目前活性硫醇荧光探针主要基于传统荧光结构如罗丹明、萘酰亚胺、香豆素、氟硼二吡咯等设计，存在生物相容性较差，抗干扰能力低及无法对亚细胞器进行定位的缺陷，极大地限制了其应用范围。绿色荧光蛋白GFP(Green Fluorescent Protein)是一种从水母中发现的生物发光大分子，其发光母核结构是咪唑啉酮。由于是生物体内的荧光团，绿色荧光蛋白具有优异的生物相容性，毒性低，斯托克斯位移大，受到生物体自身的背景干扰小，安全可靠，在现有技术中基于绿色荧光蛋白结构的活性硫醇荧光探针报道极少。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种灵敏度高、生物相容性好的绿色荧光蛋白类探针，该荧光探针分子ML-FP可作为溶酶体定位活性硫醇荧光探针。

本发明的第二个目的是提供上述荧光探针分子ML-FP的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述荧光探针分子ML-FP作为溶酶体定位活性硫醇荧光探针在活细胞荧光成像、荧光传感、生物荧光分析、荧光标记或生物硫醇检测方面的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种荧光探针分子ML-FP，结构式如下：

该荧光探针分子ML-FP由吗啉吲哚荧光蛋白衍生物M与2，4-二硝基苯磺酰氯反应制得，所述吗啉吲哚荧光蛋白衍生物M结构式如下：

本发明另一方面提供了该荧光探针分子ML-FP的制备方法包括：在0℃冰水浴中，缓慢滴加三乙胺至吗啉吲哚荧光蛋白衍生物M与2，4-二硝基苯磺酰氯的无水二氯甲烷溶液中，逐渐升至室温反应12h，柱色谱提纯，即得所述荧光探针分子。

其中，所述三乙胺：吗啉吲哚荧光蛋白衍生物M：2，4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1.5∶1.0∶1.2。

本发明另一方面提供了上述荧荧光探针分子ML-FP在作为溶酶体靶向定位活性硫醇荧光探针方面的应用。