[发明专利]突变型葡萄糖氧化酶及其利用

说明书

本发明涉及突变型葡萄糖氧化酶及其利用。使用对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基被置换成在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基而成的突变型葡萄糖氧化酶，使其藉由该具有反应性官能团的氨基酸残基结合电子受体，得到电子受体修饰葡萄糖氧化酶。

技术领域

本发明涉及通过在葡萄糖氧化酶中导入定点突变而赋予新功能的方法以及导入了突变的葡萄糖氧化酶。

背景技术

很早就开发出了使用葡萄糖氧化酶(GOX)的生物传感器。首先开发出了以非专利文献1为代表的被称为所谓第一代型的测定葡萄糖浓度的方法，该方法是通过将随着体系中的葡萄糖的氧化反应而发生的副反应O₂→H₂O₂的产物利用铂电极等进行氧化而测定葡萄糖浓度的方法。之后，开发出了不依赖于该不稳定的O₂或H₂O₂而在体系中添加电子受体(介质)来介导GOX与电极间的电子传递的第二代型(非专利文献2)。此外，在非专利文献3中表明，通过与石墨烯等碳纳米颗粒组合，即使不添加电子受体，也能够检测出由葡萄糖氧化反应生成的电子。

另外，发明人在非专利文献4和专利文献1中公开了被称为第2.5代型的通过对葡萄糖脱氢酶(GDH)等在分子表面进行电子受体的化学修饰而能够直接观测电子传递的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2018/062542

非专利文献

非专利文献1：Clin Chem 1978,24(1)150-152

非专利文献2：Biosensors 1989,4(2)109-119

非专利文献3：Mater Sci Eng C Mater Biol Apple 2017 Jul1；76,398-405

非专利文献4：Bioelectrochemistry 2018 Jun,121:185-190

发明内容

葡萄糖氧化酶在其热稳定性和底物特异性方面优于GDH，因此认为，若能够通过对葡萄糖氧化酶分子本身进行改造而在不向反应体系中添加游离型电子受体的情况下容易地进行电极的电子传递，则对于制作稳定且高精度的生物传感器是有用的。

但是，葡萄糖氧化酶并不容易应用于葡萄糖传感器中。即，在第一代型的传感器中，需要施加高电压，第二代型是进行电子受体的检测的系统，但存在由被测物的溶解氧浓度所带来的干扰影响，即使是第三代型的直接电子传递型传感器，也需要为了使电极容易接近酶的活性位点而进行设计，具有电极制作非常复杂、难以控制的问题。

另外，在非专利文献4和专利文献1中公开了电子受体对GDH的化学修饰，但该技术不容易应用于葡萄糖氧化酶。

本发明人为了将葡萄糖氧化酶制成可直接进行电子传递的酶，对电子受体的化学修饰进行了研究。在该研究中得到了在利用电子受体对葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中存在的侧链氨基进行随机修饰的情况下无法进行直接电子传递这样的结果，因此，从葡萄糖氧化酶的立体结构及其与GDH的结构类似性等出发，对于要利用电子受体进行修饰的氨基酸进行了详细的研究，在葡萄糖氧化酶中进行了突变导入。