[发明专利]一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法

权利要求书

1.一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、重组质粒的构建

以重组慢病毒载体pLenti-puro为骨架，将目的蛋白基因构建到重组慢病毒载体上获得重组质粒pLenti-puro-P；

步骤二、高表达细胞株的培育

利用PEI转染方法将上述重组质粒与辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞获得重组慢病毒；

将上一步骤收获的慢病毒转导293T细胞，经嘌呤霉素筛选获得多个单克隆细胞株，细胞培养进行细胞膜制备后，经Elisa方法检测各细胞中目标膜蛋白含量，确定高表达细胞株；

将筛选得到的高表达细胞株加入细胞培养装置中进行培育，培育过程中每隔设定时间T₁进行采样，对细胞培养装置内的细胞培养液的成分进行测定；

步骤三、膜蛋白的提取与纯化。

2.根据权利要求1所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，所述步骤三中膜蛋白的提取与纯化方法具体为：

S1、通过细胞刮刀采集细胞培养装置内的细胞，将采集的细胞加入PBS缓冲液中，清洗后3000g条件下离心除去表面上清液，加PBS缓冲液到收集的细胞中，匀浆破碎细胞，将匀浆液加入离心管中；

S2、将离心管放入离心机中，13000g离心20min后收集上清液，上清液在40000g条件下离心2h；

S3、除去上清液，在沉淀中加入膜蛋白溶解缓冲液，重悬沉淀溶解膜蛋白，再将溶解缓冲液在400000g条件下离心2h，收集上清液，得到膜蛋白溶解液；

S5、根据目标膜蛋白的性质将其与其它蛋白质进行分离纯化。

3.根据权利要求2所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，所述PBS缓冲液中加有核酸酶与蛋白酶抑制剂。

4.根据权利要求1所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，所述细胞培养装置的采样方法为：

SS1、当传感器检测到数值出现问题或达到采样时间时，开始进行采样工作；

SS2、对采样口(11)的管道内壁进行清洗干燥后，将采样接头(2)的插入管(23)一端插入采样口(11)内，再依次连接采样容器(3)、负压泵(4)、三通阀(5)、臭氧发生器(52)与氧气瓶(53)，在该步骤中不对采样口的管道内壁进行消毒；

SS3、调节三通阀(5)，接通臭氧发生器(52)，臭氧发生器(52)工作并通过臭氧对各部件进行消毒；

SS4、消毒结束后，调节三通阀(5)，开启氧气瓶(53)，通过氧气将管道中的臭氧与残余的空气排出，在采样容器(3)内形成氧气气氛；

SS5、开启负压泵(4)调节压强、开启采样口(11)上的阀门，将采样口(11)内的细胞培养液抽取部分进入采样容器(3)中，采样结束后，关闭负压泵(4)，继续开启氧气瓶(53)一段时间，调节采样容器(3)中的气压至一个大气压后，拆除管道连接；

SS6、对第二软管(31)、采样接头(2)进行清洗消毒。

5.根据权利要求1所述的一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法，其特征在于，步骤二中所述细胞培养装置包括细胞培育池(1)、采样接头(2)、采样容器(3)与负压泵(4)，所述细胞培育池(1)的一侧面上分别设置有进液口(12)、氧气浓度传感器(13)、二氧化碳浓度传感器(14)与pH传感器(15)，所述细胞培育池(1)的另一侧面上设置有采样口(11)，采样口(11)上设置有阀门；

所述采样接头(2)包括外端套管(21)、插入管(23)与引气管(22)，所述外端套管(21)与插入管(23)同轴设置且相互接通，插入管(23)的外壁上设置有若干橡胶圈，所述引气管(22)的一端与外端套管(21)的侧壁接通；

所述插入管(23)插入采样口(11)中并与采样口过盈配合，所述引气管(22)通过第一软管(51)连接三通阀(5)的出气口，三通阀(5)的两个进气口分别连接有臭氧发生器(52)与氧气瓶(53)，所述外端套管(21)通过第二软管(31)与采样容器(3)接通，采样容器(3)通过第三软管(41)连接负压泵(4)。