[发明专利]一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)重组菌，其特征在于，所述重组菌敲除了4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶基因ubiA，敲除分支变位酶基因aroH同时增强表达1,4-二羟基-2-萘甲酸聚异戊二烯基转移酶基因menA、邻琥珀酰苯甲酸合成酶基因menC和2-琥珀酰-5-烯醇丙酮酰-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸合成酶基因menD。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述4-羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分支变位酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述1,4-二羟基-2-萘甲酸聚异戊二烯基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述邻琥珀酰苯甲酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述2-琥珀酰-5-烯醇丙酮酰-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27为宿主菌，所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilis natto)ND-1-A27的保藏号为CCTCC NO:M2018131。

5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以pMA5作为表达载体进行基因敲除或基因的增强表达。

6.一种权利要求4所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计合成核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的Cas9蛋白表达框，核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的sgRNA scaffold表达框，和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的sgRNA片段；

(2)将Cas9蛋白表达框连接到pMA5表达载体上，获得质粒pMA5-Cas9；

(3)将sgRNA scaffold表达框连接到质粒pMA5-Cas9上；

(4)提取纳豆芽孢杆菌ND-1-A27基因组DNA，扩增ubiA上下游各500bp，将基因menA扩增共同作为同源修复序列，将所述同源修复序列连接到步骤(3)的质粒上，获得纳豆芽孢杆菌基因编辑载体pMAC；

(5)将纳豆芽孢杆菌基因编辑载体pMAC电转至ND-1-A27感受态中，筛选得到ubiA敲除，menA增强表达的纳豆芽孢杆菌，并进行无抗性传代，消除质粒实验，最终获得无抗性纳豆芽孢杆菌ND-1-A27A△ubiA；

(6)提取纳豆芽孢杆菌ND-1-A27基因组DNA，扩增aroH上下游各500bp，将基因menC、menD扩增共同作为同源修复序列，将所述同源修复序列连接到步骤(3)的质粒上，获得纳豆芽孢杆菌基因编辑载体pMAC-1；

(7)将纳豆芽孢杆菌基因编辑载体pMAC-1电转至ND-1-A27A△ubiA感受态中，筛选获得aroH敲除并且增强表达menC及menD的纳豆芽孢杆菌ND-1-A27ACD△ubiA△aroH；

所述的纳豆芽孢杆菌ND-1-A27的保藏号为CCTCC NO:M2018131。

7.权利要求1～5任一项所述的重组菌在发酵生产维生素K₂ MK-7和γ–聚谷氨酸中的应用。

8.一种权利要求1～5任一项所述的重组菌发酵生产维生素K₂ MK-7和γ–聚谷氨酸的方法，其特征在于，将所述重组菌单菌落接种于种子培养基中，35～38℃、100～150r/min培养6～10h得到种子培养液；以1～5％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，35～38℃培养3～6天，得到发酵液，从发酵液中分离提取得到维生素K₂ MK-7和γ–聚谷氨酸。