[发明专利]利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法及用途

权利要求书

1.利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、在需要克隆的目的基因两段添加和py-2u载体同源的长度40-60bp的同源序列；

S2、将步骤S1得到的基因分为多个小片段，两段添加单独的酶切位点；每个小片段两端的酶切位点为同一个酶切位点，或不同的单独的酶切位点；

S3、每个小片段通过基因合成或PCR扩增得到，产物平端连接到克隆载体或TA克隆到小片段载体；

S4、将每个片段用所述单独的酶切位点进行酶切，回收产物后用于下一步的酵母转化；

步骤S4酵母转化的具体步骤如下：

1）挑平板上的酵母单克隆摇菌，于4mL液体YPD培养基培养过夜，次日将2mL培养基转移至50mL液体YPD培养基继续培养4-6h，至OD达到0.5-0.8；将菌液收集并离心沉淀，加0.1M醋酸锂溶液重悬用于转化；

2）将DNA片段和线性化载体加入上一步骤得到的酵母菌；

3）将DMSO-醋酸锂-PEG加入上一步液体，混匀，放入恒温孵育装置进行孵育处理，关闭密闭门（200），开启伺服电机（450），伺服电机（450）进一步带动转轴（460）、多试管安装板（510）的转动，使得样品发生高速搅拌，促进试管中样品的离心混合；

4）离心后弃上清，用ddH₂O重悬细胞，涂板，涂布于SC-TRP平板，30℃培养2-3天；

步骤2）中每个DNA片段的添加量按摩尔比例1:1添加，各添加50-100ng，线性化载体添加200-500ng；

步骤3）孵育处理的条件为37℃孵育30min，42℃反应30min；

所述Py-2u载体包括高拷贝类型Py-2uH和低拷贝类型Py-2uL；

PY-2u载体的同源序列分别为：

（1）同源序列1：

TGAGCCcgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagt；

（2）同源序列2：

atcggatgccgggaccgacgagtgcagaggcgtgcaagcgagcgtcgacGC；

该方法用于长基因的基因合成和基因组装，该基因组装包括基因组的组装；

基因组装的质粒构建步骤如下：（1）将带有目标载体同源序列的基因全长克隆到Py-2u；（2）酶切全长基因并通过Gibson重组重组到目标载体。