[发明专利]一种实时指示凋亡水平的稳转细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种实时指示凋亡水平的稳转细胞系及其构建方法和应用，所述细胞系含有线性多肽DnaEC‑Fluc‑C‑DEVD‑Fluc‑N‑DnaEN‑PEST，且在Fluc‑C‑DEVD‑Fluc‑N的两端带有NotⅠ和XbaⅠ酶切位点。所述构建方法包括以下步骤：构建含有线性多肽的质粒；包装慢病毒；再感染宿主细胞，进行药物筛选、亚克隆培养。本发明选用萤火虫荧光素酶作为报告基因用以构建含有Caspase‑3识别基序DEVD的稳转细胞系。当凋亡现象发生，DEVD被剪切出来，萤火虫荧光素酶基因的N、C端相互靠近激活发出荧光从而判定凋亡情况。该方法灵敏度高、操作简便且省时高效，有望成为筛选抗肿瘤药物的新方法。

技术领域

本发明涉及一种实时指示凋亡水平的稳转细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

细胞凋亡，又称细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)，是指细胞为了更好地适应生存环境而采取的主动死亡过程。细胞凋亡受基因调控，贯穿于生物体生命活动的全部过程，它不仅在胚胎和大脑的发育及机体免疫等过程中扮演重要角色，而且在心血管疾病、神经性病变及肿瘤的发生发展过程中起到至关重要的作用。研究表明，Caspase家族在细胞凋亡的调节与执行过程中的作用至关重要。因此建立一个快速检测Caspase蛋白酶活性的方法，有利于尽早判断细胞的凋亡状态，且可以为筛选干预细胞凋亡状态的药物提供方便快捷的途径。

细胞凋亡主要分为内源性凋亡途径(Intrinsic pathway)和外源性凋亡途径(Extrinsic pathway)。其中Caspase-3蛋白是内源性凋亡途径与外源性凋亡途径的汇集点且在凋亡早期被激活，因此Caspase-3可被作为细胞凋亡的早期判断指标之一。为建立一种快速高效检测鉴定细胞凋亡的方法，之前已有研究者将Caspase-3作用的底物与荧光共振能量转移肽对或D-荧光素进行连接用以检测Caspase-3的活性，但是这种检测方法的灵敏度较差且实验过程较为繁琐。

诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的重要策略,在活细胞内实时动态地监测细胞凋亡的水平,对于阐明肿瘤治疗的分子机制和加速抗肿瘤的发现具有重要的价值。但受制于各种因素，目前尚未见有凋亡指示细胞系的任何报道。本专利采用慢病毒包装方法，将Caspase 3特异性的识别基序DEVD为接头，将萤火虫荧光素酶(Fluc)的N端和C端反向串联，并在内含肽的作用下可形成环形肽段的重组质粒导入Hela细胞，构建成稳转细胞系。若该细胞发生凋亡，细胞内Caspase 3活化则将DEVD特异性切割使Fluc产生活性，后续可通过检测Fluc活性程度来实时评价细胞的凋亡水平。实验表明该方法简单可行，具有良好的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种实时指示凋亡水平的稳转细胞系及其构建方法和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种实时指示凋亡水平的稳转细胞系，所述细胞系含有线性多肽DnaEC-Fluc-C-DEVD-Fluc-N-DnaEN-PEST，且在Fluc-C-DEVD-Fluc-N的两端带有NotⅠ和XbaⅠ酶切位点。

第二方面，本发明提供了一种实时指示凋亡水平的稳转细胞系的构建方法，包括以下步骤：

A、扩增带有DEVD位点的Fluc基因片段Fluc-DEVD，构建含有线性多肽DnaEC-Fluc-C-DEVD-Fluc-N-DnaEN-PEST的质粒Phage-Fluc；

B、包装慢病毒；

C、将包装好的慢病毒感染宿主细胞后，进行药物筛选，筛选后挑选单细胞进行亚克隆培养，即得所述稳转细胞系。

优选地，步骤A中，所述扩增带有DEVD位点的Fluc基因的具体步骤如下：