[发明专利]一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用

说明书

本发明涉及一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗及其应用，本发明制备的无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种，系重组表达经过密码子优化的气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素A重组融合蛋白的大肠杆菌，用该菌种生产的气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗可以最大限度地保证疫苗的安全性，又保持其有效性。同时，该菌种表达的疫苗抗原能够以可溶的形式表达，一方面避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本；一方面能够提高融合蛋白的抗原性，因此具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行气肿疽梭菌疫苗升级换代的理想候选疫苗。

技术领域

本发明涉及一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用。属兽用生物制品领域。

背景技术

气肿疽梭菌病又俗称为黑腿病，主要感染反刍动物，特别是放牧的新生反刍动物对气肿疽梭菌最敏感。该病病程短，发病急，往往来不及救治就突然死亡。为此，疫苗接种是防控该病的主要手段，而商品化的气种疽疫苗主要是强毒力菌株C54-1和C54-2两株的灭活疫苗。该疫苗在预防动物气肿疽方面虽然取得了一定的效果，但疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；其在制备过程中涉及强毒力气肿疽梭菌的灭活，存在菌株外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的气肿疽梭菌病基因工程疫苗，是未来的发展方向。

气肿疽梭菌的主要毒力因子有鞭毛、细胞毒素A(CctA)以及唾液酸酶以及其他毒力因子，包括代表耐氧的溶血素、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶及不耐氧的溶血素(VileiEM,JohanssonA,Schlatter Y,Redhead K,Frey J.Genetic and functionalcharacterization of the NanA sialidase from Clostridium chauvoei.Vet Res2011；42(1):2.)。其中，鞭毛与气肿疽的毒力密切相关，且鞭毛蛋白具有良好的免疫原性，能够对气肿疽提供免疫保护反应(Chandler HM,Gulasekharam J.The protectiveantigen ofa highly immunogenic strain ofClostridium chauvoei including anevaluation ofits flagella as aprotective antigen.J Gen Microbiol 1974；84(1):128-34；TamuraY,Kijima-Tanaka M,AokiA,Ogikubo Y,Takahashi T.Reversibleexpression of motility and flagella in Clostridium chauvoei and theirrelationship to virulence.Microbiology 1995；141(Pt 3):605-610.)。已有的研究发现，外源表达的鞭毛蛋白FliA(C)能够诱导小鼠产生较好的体液免疫应答和细胞免疫应答(气肿疽nanA与fliA融合基因亚单位疫苗的制备及免疫效果评价[D].延边大学,2014.)。2012年，Joachim等人发现了气肿疽梭菌的一种新型毒素，命名为气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)。该毒素是细菌毒素的杀白细胞素总科、β-微孔形成毒素家族中的一种，在气肿疽梭菌中很保守。进一步的研究发现，天然的CctA以及通过大肠杆菌表达的融合蛋白rCctA::NusA和酶切后去掉标签的rCctA均具有很强的细胞毒性和溶血活性。针对rCctA的兔多克隆抗体能够完全中和rCctA和气肿疽培养物的细胞毒性和溶血活性，这说明CctA是气肿疽梭菌的主要细胞毒素和溶血因子。此外，Joachim等人还发现利用外源性融合蛋白rCctA::LTB免疫的动物能够获得对气肿疽梭菌的免疫保护(Frey J,Johansson A,Sibylle Bürki,etal.Cytotoxin CctA,a major virulence factor of Clostridium chauvoei conferringprotective immunity against myonecrosis[J].Vaccine,2012,30(37),5500-5505)。最新的研究发现，CctA的中间区域(第95位～261位氨基酸，以下成为CctA_N)能够在真核细胞表达，并可作为核酸疫苗进行免疫，诱导实验动物产生较好的体液免疫应答和细胞免疫应答(齐强.牛气肿疽CctA基因核酸疫苗的制备及免疫效果评价[D].2017.)。