[发明专利]基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法

说明书

本发明涉及生物工程技术，提供了基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法，具体步骤为：装载PCL注射器，移至3D生物打印机的第一打印架上，将明胶支架材料加入到第二注射器内，移至打印机第二打印架上，将纤维蛋白凝胶和细胞混合物加入到第三注射器内，移至打印机第三打印架上，调整软件和PCL注射器，使用3D生物打印平台构建PCL框架，并在PCL框架上建立凹槽，将明胶支架材料打印填充至PCL框架内，将纤维蛋白凝胶与细胞混合物打印固定于PCL框架上形成条带，然后悬浮于培养基中，通过纤维蛋白回缩和细胞张力所产生的牵张力控制血管的分支形成，从而能够构建预血管化的组织工程组织或器官，解决组织工程组织和器官的缺血问题。

技术领域

本发明涉及生物工程技术，具体涉及基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法。

背景技术

3D打印血管的模式主要有两种，一种是间接打印，一种是直接打印。间接打印是打印一种可牺牲的填充物构建模型支架，溶解后产生管道系统。另一种采用含细胞的生物墨水支架打印血管结构。两种方式的联合应用能更好地制作出符合要求的血管结构。例如：采用直接打印控制细胞的位置构建微米级的毛细血管网络结构，同时采用间接打印的模式制作模型管道，然后灌注细胞，从而构建毫米级的大血管。

在微挤压型打印技术的基础上，Gao团队[Biomaterials. 2015，61:203-15]发明了一种挤出型共轴打印头，分为内外两个管道，内管道可以投放钙盐溶液，而外管道可投放藻朊酸盐溶液，打印出的结构自身携带可灌注的微管道，随着载物台的降低，打印结构浸入到钙盐溶液中进行二次交联。打印精度可达900微米。增加微管道数目可提高细胞的成活率。缺点是虽然藻朊酸提供了直线、生物相容性较好的微挤压打印方法，但由于缺乏自支撑，很难打印出复杂的组织或器官。Kolesky等 [Adv Mater. 2014，26(19):3124-30]采用类似的方式按照既定程序同时打印Pluronic F127 和混有细胞的 Gelatin-methacrylate(GelMA)。包裹在无细胞的GelMA中的打印结构通过光聚合作用交联基质。Pluronic F127通道会在温度降低时溶解，随后灌注HUVECs完成血管化组织结构的构建。

Miller等[Nat Mater. 2012,11(9):768-74]采用生物打印机以碳水化合物玻璃为支架材料构建3D血管网络，制作完毕后10分钟，灌注35×106cell/ml的HUVECs悬液，培养基中静置1小时，然后继续灌注，1天后HUVECs即可铺整个管道系统。再生血管的功能在以兔肝细胞为主的组织工程组织中得到了验证。

现在打印机的细胞打印精度为150-200微米，还不能直接打印出10-20微米的毛细血管网结果[Trends Biotechnol. 2015,33(7):395–400]。但除了打印机的直接调控外，生物墨水在打印过程中或过程后都可以对内皮细胞发育过程进行调控[Adv Mater. 2014,26(19):3124–30]。

Lee等[Biomaterials. 2014,35(28):8092-102]在HUVEC-明胶管道周围投放胶原，培养过程中当明胶溶解后，HUVECs会沉降而粘附在周围的胶原管壁上。作为细胞外基质的组成成分的胶原可以促进HUVECs的内皮化，进而增加血管管壁的完整性。

Norotte等[Biomaterials. 2009,30(30):5910–7]将脐静脉平滑肌细胞及成纤维细胞制作成细胞球，将细胞球与琼脂糖条带一起打印，琼脂糖条带作为打印导板，形成直线或分支装的血管结构。打印结构经培养后细胞球会相互融合形成单层或多层的小直径空腔血管（直接为0.9-2.5 mm）。