[发明专利]一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒，检测方法，包括如下内容：采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物；提取分泌物中的DNA核酸；设计引物和探针；配制海分枝杆菌核酸检测试剂；取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；待恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果；本发明无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸，具有耗时短、操作简便的优点，本发明运用独特的方法设计出的引物和探针，使得检测灵敏度高、特异性好；再通过实验优选出引物探针优选和最优的工作浓度范围，从而进一步提高试剂盒的检测的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种海分枝杆菌核酸的检测方法及其试剂盒。

背景技术

海分枝杆菌是一种生长在淡水和海洋中的非结核分枝杆菌，主要感染鱼类、蛙类、虾类等水生生物，也可以通过皮肤表面的微小伤口感染人类，形成肉芽肿样病变。临床患者大多因被水产品刺伤手部，或在受污染的水域游泳引起感染。海分枝杆菌的最适生长温度约为32℃，温度上升至37℃时细菌生长受到抑制。因此，临床发现的感染灶大多位于人体四肢和皮肤等温度较低的表浅位置，免疫力低下的患者有可能发生全身感染。感染症状一般表现为迁延不愈的皮肤肿块，可伴有疼痛、破溃流脓等症状，临床容易误诊为腱鞘炎、关节炎、或结核分枝杆菌感染，从而延误治疗。治疗延误有可能导致病灶大面积坏死，严重时甚至有截肢风险。因此，及时诊断病原体类型是治疗海分枝杆菌感染的首要措施。

目前海分枝杆菌的诊断还没有统一标准。根据2016年《非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识》，海分枝杆菌的诊断需要先从临床样本中分离培养分枝杆菌，再通过分子生物学方法进行菌种鉴定，最终锁定致病菌。海分枝杆菌虽然属于快速生长的分枝杆菌，但分离培养依然需要至少一周到两周时间，再加上后续菌种鉴定的耗时，极大地耽误了患者的确诊和治疗时间。

市场需要一种无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸的方法，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒，本发明无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸，具有耗时短、操作简便的优点，通过本方法设计出的引物和探针，使得检测灵敏度高、特异性好，具备良好的临床应用前景。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，包括如下内容：

采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物；

提取分泌物中的DNA核酸；

设计如下5条引物和探针，

SEQ ID NO.1：5’-TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT；

SEQ ID NO.2：5’-Biotin-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG；

SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC；

SEQ ID NO.4：5’-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A；

SEQ ID NO.5：5’-TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC；

配制海分枝杆菌核酸检测试剂，检测试剂包括：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，DNA聚合酶，DNA聚合酶缓冲液，MgSO₄溶液，dNTP，蒸馏水，DNA样品；

取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；