[发明专利]一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法

权利要求书

1.一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）收集细胞及提取蛋白

2）细胞裂解物的染毒及蛋白酶消化

蛋白样品分为两份，其中一份加入BPDE的DMSO溶液，另外一份加入等体积的DMSO溶剂，室温下静置孵育，孵育后的样品分别转入两个PCR管中，分别加入嗜热菌蛋白酶，在37℃条件下进行消化，然后分别加入4℃条件下预冷的蛋白酶抑制剂；

3）质谱前样品准备

加入蛋白酶抑制剂后的样品中分别加入尿素裂解液，4℃条件下离心，收集上清液；然后分别加入二硫苏糖醇，37℃条件下静置；然后冷却至室温后分别加入吲哚乙酸，室温避光下振荡；分别加入碳酸氢铵溶液以及胰蛋白酶，37℃条件下孵育；再分别加入三氟乙酸溶液，终止反应；酶解后的肽段分别使用C18 Cartridge固相萃取柱脱盐，真空冻干，用0.1%甲酸水溶液复溶，肽段浓度测定，以备LC-MS/MS分析；

4）LC-MS/MS分析

取肽段进行色谱分离；肽段分离后用质谱仪进行DDA质谱分析；

5）质谱数据库检索

下载蛋白质数据库，根据质谱分析数据筛选出两份蛋白样品间的差异蛋白，获得BPDE靶蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤1）包括：收集细胞，加入4℃条件下预冷的PBS缓冲液，然后在液氮中速冻1min，取出后在25℃水浴中摇晃解冻，液氮速冻以及解冻步骤循环4次；然后在20000×g、4℃条件下离心20min，吸取上清液置于新的离心管中，弃去沉淀，即为所提取的蛋白样品。

3.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤1）在提取获得蛋白后，测定蛋白样品中的蛋白质浓度，在步骤2）中加入嗜热菌蛋白酶时按照每10µg蛋白加入1µg嗜热菌蛋白酶的比例。

4.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤3）在收集获得上清液后测定上清液中蛋白样品的浓度，然后加入胰蛋白酶时按照每120µg蛋白加入4µg胰蛋白酶的比例。

5.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤4）的色谱分离采用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统进行，其中缓冲液的A液为0.1vol%甲酸溶液，B液为甲酸乙腈水溶液，其中甲酸乙腈的含量为0.1vol%，甲酸与乙腈的体积比为15:85。

6.根据权利要求5所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤4）的色谱分离时，色谱柱以95%的A液平衡。

7.根据权利要求6所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤4）的蛋白样品在进行梯度分离时，液相梯度设置为：0min-2min，B液线性梯度从5%-8%；2min-90min，B液线性梯度从8%-23%；90min-100min，B液线性梯度从23%-40%；100min-108min，B液线性梯度从40%-100%；108min-120min，B液维持在100%。

8.根据权利要求1所述的一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法，其特征在于，步骤4）的过程中温度不高于37℃。