[发明专利]一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法，通过向细胞悬液中分别添加含有携带目的基因的真核细胞表达载体质粒、DMEM高糖培养基和转染试剂的转染复合物，并在细胞培养过程中进一步添加转染增强子，在培养的不同阶段添加补料培养基，本发明不仅做到高效率、低成本的基因瞬时转染，还实现了快速稳定地表达重组蛋白。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法及其应用。

背景技术

通常意义上所说的蛋白表达，多指稳定的基因表达技术。稳定的基因表达技术是生物生产系统的金标准；然而，该过程需要耗费大量时间，从而不利于大通量、高效率地发现新的药用蛋白质。

基因瞬时表达是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上而不整合到染色体上，较短时间内就可获得基因的表达产物，但随着细胞的分裂增殖，这种外源基因最终会消失，其持续时间约为几天到两周。具体地，基因瞬时表达是指DNA进入宿主细胞后，不整合到宿主细胞的基因组DNA上，只是利用宿主细胞的蛋白表达体系，在转染后的某个时间段内表达外源蛋白或病毒；和稳定表达相比，瞬时表达法操作简易、周期短。传统的稳定表达系统，从转染到获得稳定表达细胞株至少需要几个月甚至更长的时间。而在瞬时表达系统中，进入细胞的外源DNA以游离形式存在于细胞中进行基因表达，拷贝数更高，而且其表达不受基因位置和基因沉默的影响。因此瞬时表达系统可能只需要2～4周就能获得足够量的外源蛋白等产物。

因此，基因瞬时表达方法为基因-蛋白质的研究提供了一种快速、方便的方法。相对于稳定的基因表达方法，基因瞬时(蛋白质)表达方法的优点有：(1)微量至中等量的重组蛋白的生产过程大大缩短；(2)可以同时转染不同的细胞系，挑选出最为合适的细胞；(3)用于难以实现稳定表达的重组蛋白质的生产；(4)用于以细胞为基础的高通量筛选。

现阶段的基因瞬时转染多是以脂质体为主，虽然其转染效率高但是其试剂成本比较高，而且对细胞有一定的毒性，适合于稳定细胞株的转染，不适合悬浮细胞的大规模的瞬时转染的生产工艺的开发。其他基因瞬时转染方法包括磷酸钙法、电穿孔法、病毒介导法等。其中，磷酸钙法转染效率低；电穿孔法不能进行大批量细胞的转染，不仅转染效率底，仪器设备的成本也很高；而病毒介导法虽然其转染效率比较理想，但是病毒的制备过程存在一定的风险，所以为了安全性的生产考虑，很难推广使用。

目前也采用高分子聚合物如PEI(聚乙烯亚胺)进行转染，根据对不同分子量(2.5-800kDa)的支链和直链PEI分子的研究结果，PEI的转染效率和细胞毒性主要是由分子量、支链化程度和阳离子电荷密度决定的。随着分子量的增大，转染效率逐渐提升，同时细胞毒性的大幅提升。与支链PEI分子相比，直链PEI分子的细胞毒性更低，同时其具有更强的对DNA分子的压缩能力，增加了形成复合物的平均粒径从而增加细胞与复合物接触的机会，最终提高转染效率。因此，如何得到更加优化的PEI转染试剂，以便有效降低PEI的生物毒性，并应用于相应的细胞培养方法，正是当前需要解决的问题。

综上所述，目前本领域亟需一种高效率、低成本的基因瞬时转染方法，以提高在所转染细胞中稳定地瞬时表达重组蛋白的表达量。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明人根据不同结构的PEI分子所具有的不同特性对PEI转染法进行改进，构建了新的复合转染试剂，其为PEI_MAX、LPEI和B-PEI的混合物，其中PEI_MAX为大分子量PEI，LPEI为线性PEI，B-PEI为支链PEI。该复合转染试剂有效降低了常规用PEI转染的生物毒性，并达到与脂质体同样甚至更好的转染效果，从而在经济实惠的条件下实现了高的细胞转染效率。

本发明的目的在于提供一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将在无血清培养基中生长好的待转染细胞如293F细胞调整细胞悬液的细胞密度后置于转染摇瓶中；