[发明专利]一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒

说明书

本发明公开一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，由PCR扩增引物、质谱延伸引物、PCR反应缓冲液、dNTP Mix、MgCl₂、Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、MassARRAY芯片等组成。本发明试剂盒能检测高苯丙氨酸血症45种热点基因变异位点，其中包括PAH基因39种变异位点，PTS基因6种变异位点，检测基因位点覆盖度高，高通量，用时短，低成本，高准确性。因此，该试剂盒应用潜力大。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，尤其涉及一种基于MassARRAY质谱平台的高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒。

背景技术

高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，HPA)是由于苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏或其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏，导致血苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)增高的一组常见的氨基酸代谢病。PAH缺乏症和BH4缺乏症均为常染色体隐性遗传病。正常状况下，天然食物中的蛋白质分解产生的Phe在肝脏PAH的作用下转化成酪氨酸，PAH缺乏可导致HPA，旁路代谢增强，大量苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸从尿中排出。BH4是PAH、酪氨酸及色氨酸羟化酶的辅酶，BH4缺乏症是由于BH4代谢途径中5种酶中的1种缺乏导致的HPA及神经递质合成障碍，其中6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyl tetrahydropterinsynthase，PTPS)缺乏最多见，其次为二氢蝶啶还原酶(dihydropteridinereductase，DHPR)缺乏，鸟苷三磷酸环化水解酶(GTPcyclohydrolase，GTPCH)、墨蝶呤还原酶(sepiapterinreductase，SR)和蝶呤4-α-甲醇氨脱水酶(pterin-4α-carbinolamine dehydratase，PCD)缺乏较少见。据报道，我国256例BH4缺乏症患者中96％为PTPS缺乏，DHPR缺乏占2.4％。1985-2011年我国3500万新生儿筛查资料显示，HPA患病率为1：10397。国际资料报道，高加索人HPA病因中PAH缺乏症占98％，BH4缺乏症约2％。2000-2007年我国新生儿筛查资料显示，HPA中12.9％为BH4缺乏症，以PTPS缺乏最常见，并存在显著的地域差异，南部地区BH4缺乏症发病率较高，台湾发病率最高。

PAH缺乏症在新生儿期多无临床症状，出生3～4个月后逐渐表现典型苯丙酮尿症(PKU)的临床特点：头发由黑变黄，皮肤颜色浅淡，尿液、汗液鼠臭味，随着年龄增长，智能发育落后明显、小头畸形、癫痫发作(多表现为痉挛发作)，也可出现行为、性格、神经认知等异常，如多动、自残、攻击、自闭症、自卑、忧郁等。由于症状缺乏特异性，临床诊断困难，易被误诊为脑性瘫痪、癫痫等神经系统疾病，需要依靠生化分析进行病因诊断。BH4缺乏症患儿除表现PKU症状外，主要表现为躯干肌张力低下，四肢肌张力增高或低下，如吞咽困难、口水增多、松软、角弓反张等。

PAH缺乏症和BH4缺乏症的病因和发病机制明确，是一种可以治疗的遗传病，基因诊断是HPA的确诊方法。患儿通过早期诊断并采用饮食控制或药物治疗方法可有效阻断病程发展，有希望像正常孩子一样成长。因此，患儿的早期检出和治疗是非常必要的，通过对PAH和BH4相关基因检测进行疾病筛查和诊断是解决该问题的重要手段。现有的基因检测方法主要包括聚合酶链反应-变性凝胶梯度电泳(PCR-DGGE)，聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，聚合酶链-短重复序列多态分析(PCR-STR)，Sanger测序，高分辨率熔解曲线法，微型DNA芯片，二代测序技术等。以上技术应用于PAH缺乏症和BH4缺乏症基因检测，都难以使检测通量和成本达到有效的平衡，而且大部分方法都存在检测的基因位点有限，增加了漏检的可能性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，是一种基于MassARRAY质谱平台的高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒。