[发明专利]一种鲫鱼脊髓组织细胞系及其应用

说明书

本发明提供了一种鲫鱼脊髓组织细胞系，该细胞系被命名为异育银鲫脊髓组织细胞系C8C37，于2018年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2018204。该细胞系可以在37℃快速繁殖，并能使病毒稳定传代。本发明还提供了选育具有类似特性的基于脊髓组织细胞系的选育方法。本发明的细胞系可以很好地应用于鲤疱疹病毒2型的研究和相关疫苗的生产中，具有成本低、耗时少、效果好的优点。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，特别涉及适用于鲤疱疹病毒2型培养的一种 鲫鱼脊髓组织细胞系。

背景技术

1992年，在日本西部养殖的金鱼稚鱼出现大量死亡，死亡率几乎达到了 100％，病原鉴定为疱疹病毒性造血器官坏死病病毒(Herpesviral haemato poietic necrosisvirus，HVHNV)，因其是第二个从鲤科鱼体内分离得到的疱疹病 毒，故命名为鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2)。2007-2008年， 我国江苏盐城地区部分养殖场发现养殖鲫鱼以体表出血、鳃出血等为主要症 状的疾病，死亡率高达90％以上，经检验，病原为鲤疱疹病毒2型。2009年以 后，该疾病在该鲫鱼主产区呈现连年大面积暴发的趋势。并以江苏盐城为辐 射点，传播至江西、湖北、安徽、浙江、广东、宁夏、河北、天津、辽宁等 地。2011年，我国出口的马来西亚的金鱼被通报检出CyHV-2病原。该病毒传 染速度快、致死率高，给我国鲫鱼及金鱼的养殖行业造成了巨大损失，严重 遏制了水产养殖行业的健康发展。

病毒学研究离不开细胞培养分离技术的支持。但目前仍未分离出适合 CyHV-2持续繁殖超过10代的细胞。Jung等发现鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papillosum cyprinid，EPC)、胖头鲤细胞(Athead minnow cellS，FHM)和罗非 鱼卵巢细胞(Tilapia ovary，TO-2)能分离出CyHV-II，但CyHV-II在以上3种细 胞中的增殖均不能超过4代。Jeffrey研究结果表明，鲤疱疹病毒在锦鲤鳍细胞 (koifin 1，KF-1)培养能出现典型的CPE(细胞病变效应)，但随着增殖代数的增 加，细胞病变范围逐渐减小，第3代病毒接种后则完全无CPE出现。

CyHV-2无法持续在细胞内繁殖，导致研究CyHV-2的人员必须重复对细胞进 行接毒，耗时耗力。

另外，现有常用的鱼类细胞系的培养温度不能超过30℃，其生长速度很 慢：传代比例1∶2的情况下每代次培养时间通常为10～14日，加重了时间成本。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种鲫鱼脊髓组织细胞系，该细胞系 被命名为异育银鲫脊髓组织细胞系C8C37，于2018年11月15日保藏于中国 典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉的武汉大学，保藏号为 CCTCC NO：C2018204。

本发明还提供了一种能在37℃快速繁殖的鲫鱼脊髓组织细胞系的选育 方法，其特征在于，包含如下步骤：

1)传代培养：将鲫鱼脊髓组织细胞系CSC置于L15细胞培养基中，24℃ 传代至F50代；所述CSC保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为： CCTCC NO：C2018194；

2)37℃驯化：将2)中冻存细胞在24℃复苏，培养3日，移入37℃环 境培养，每2日更换培养基并倒掉漂浮死细胞，直至细胞长满单层；每次更 换培养基前，培养基必须37℃预热；

3)快速生长细胞筛选：在37℃传代培养，传至F60代，筛选生长最快 的一瓶细胞；

4)血清驯化：前述筛选后，F61-F62代用1号L15完全培养基培养，F63-F67 代用2号L15完全培养基培养，F68-F79代细胞用3号L15完全培养基培养； 所述1号L15完全培养基含有5％胎牛血清和5％新生牛血清，所述2号L15 完全培养基含有10％新生牛血清，3号L15完全培养基含有5％新生牛血清。