[发明专利]基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法

说明书

本发明公开了基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法。基于黄瓜基因组序列信息，筛选设计黄瓜染色体的寡核苷酸文库，并通过双接头的连接方式将寡核苷酸文库进行分段。在此基础上，提出了一种基于多重PCR的寡核苷酸探针合成方法，根据实验需要自主选择合成所需的染色体区段，通过PCR快速的合成大量满足实验所需的寡核苷酸探针。本发明基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法，可以大量、快速、简便、永久的合成分段寡核苷酸探针和整条染色体的探针，为寡核苷酸探针的推广应用创造了条件，同时也为植物染色体研究提供了灵活、有力的方法。

一、技术领域

本发明公开了基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法，有利于开展经测序植物染色体的细胞遗传学研究，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

利用荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)，使研究对象的特定染色体区段、染色体臂或整条染色体发出某种颜色的荧光，从而可以在荧光显微镜下可视化染色体的技术称为染色体涂染，该技术大大加深了我们对染色体结构及变化的理解。例如，利用该技术分析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因(Ried et al.，1998)；此外，染色体涂染技术未经过基因组测序的近缘种间基因组的比较研究提供了新的方法，通过种间比较染色体涂染的方法能直观地展示物种间的染色体结构的差异，从而我们可以分析近缘物种间染色体的重排关系(Jiang et al.，2006)。

但是，由于植物细胞壁和植物染色体中大量重复序列的存在，使得植物染色体涂染在很长时间都难以开展。大量的研究者进行了诸如大片段克隆(BAC、YAC、Fosmid克隆等)探针、单拷贝探针等改进使该技术可以应用于植物染色体研究中(Fransz et al.，2000；Lysak et al.，2003，2006；Mandakova et al.，2010；Lou et al.，2014)。但是，由于探针制备过程繁琐且劳动密集(Lysak et al.，2013)，对染色体制片技术要求较高，在植物的染色体研究中应用仍然比较有限。

近年来，寡核苷酸合成技术的发展为解决植物染色体研究的问题开创了一种新的方式(Cuadrado et al.，1998，2002)。Han等(2015)通过筛选已测序植物物种基因组中特异的寡核苷酸制成的寡核苷酸探针，可以便捷的完成对植物特异染色体区段或染色体的全长的涂染。因此，该方法对经测序的植物染色体研究有较大的潜力，并且已经在部分物种如草莓、马铃薯、番茄、茄子上都进行了许多成功的研究(Qu et al.，2017；Braz et al.，2017)。

但是，由于对寡核苷酸探针的应用还处于起步阶段，现有的寡核苷酸探针合成方法复杂、劳动密集且耗时长，此外，合成寡核苷酸探针所需的试剂价格高昂，一次性投入较大，所以实际研究中使用较少。为此我们提出了一种基于多重PCR的分段寡核苷酸探针涂染的技术。该技术基于黄瓜的基因组序列信息，筛选合成了黄瓜染色体的寡核苷酸文库，在探针设计过程中使用双接头的方式将染色体文库进行分段，通过多重PCR的方法简便、快捷的合成大量实验所需的某一段、某几段或整条染色体的寡核苷酸探针，使得寡核苷酸探针的利用更加简便、灵活，通过合成双链的寡核苷酸探针还可以加强信号的强度。该技术有利于寡核苷酸探针在植物染色体研究中的推广应用。

三、发明内容

技术问题

本发明利用黄瓜基因组信息，筛选合适的寡核苷酸并进行双接头分段设计，选取对应的带有荧光基团标记的引物，通过多重PCR合成所筛选的寡核苷酸探针经纯化后即可用于植物染色体研究，是针对寡核苷酸探针合成技术繁琐、且合成文库固定无法灵活利用的问题，开发出的一种仅通过PCR即可灵活利用寡核苷酸探针的方法。

技术方案

本发明所基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法，其实施方案如下：

1)针对黄瓜4号染色体，以黄瓜‘9930’基因组为参考，通过Chorus软件筛选所需的寡核苷酸文库。