[发明专利]一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性引物SP2908及PCR检测方法

说明书

本发明为一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性引物及PCR检测方法，其设计特异性引物并建立用于检测毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性PCR检测方法，为鸡毒害艾美耳球虫的临床检测应用和推广提供理论依据和技术支撑。本发明采用的技术方案为：所述特异性引物序列如下：SP2908‑F：5’‑GACAATCATACA CACTGGGC‑3’；SP2908‑R：5’‑AGATGCCTC TTCCAAAGC‑3’。特异性引物在检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中的PCR检测方法为：以待测样本的cDNA为模板，以特异性引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现286bp目的条带，则待测样本为毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。

一、技术领域：

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性引物及孢子化卵囊的特异、灵敏、快速PCR检测方法，其能够对鸡饲养过程中存在于环境、饲料、水及各种可能造成球虫卵囊污染的因素进行鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊快速准确检测。

二、背景技术：

鸡球虫病是严重危害养鸡业的疾病之一，呈全球性分布。随着集约化养殖的发展，本病的危害日益严重，给养鸡业带来了严重的经济损失，估计全球每年因球虫病的损失超过30亿美元。毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)是7种鸡球虫中致病性最强的球虫种类之一，多发生于8～18周龄的育成鸡，可引起鸡的急性小肠球虫病，在商品鸡饲养过程中，其自然感染引起的死亡率可以超过25％。除引起发病死亡外，毒害艾美耳球虫的感染还可导致饲料报酬降低和生产性能下降等其他损失。毒害艾美耳球虫的生活史包括宿主体内的裂殖生殖、配子生殖和外界环境中的孢子生殖三个阶段。未孢子化卵囊随粪便排出体外，只有经孢子生殖发育为孢子化卵囊才具有感染性，因而卵囊孢子化是球虫侵袭力形成的关键因素之一。所以，建立一种特异、高效的球虫孢子化卵囊检测方法对于鸡球虫病的防控具有重要意义。

目前，临床上检测鸡球虫的常用方法主要有传统形态学观察以及常规PCR、巢式PCR、多重PCR、Real-time PCR等分子生物学方法。传统形态学观察需要检测人员具备一定的专业知识，并且耗时耗力检出率较低。PCR等分子生物学方法灵敏、特异，可有效区分不同鸡球虫种类，在鸡球虫的鉴别和诊断方面已得到广泛应用。现已有研究者利用18S rDNA序列、ITS-1序列等设计特异性引物建立PCR方法鉴别球虫种类，但是目前国内尚缺乏对于毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性PCR检测方法，无法在分子生物学水平有效鉴别孢子化卵囊和未孢子化卵囊。近年来有关卵囊孢子化过程中分子活动的研究表明，存在只在孢子化阶段表达的特异基因，其转录活动的増加对于子孢子的形成起着尤为重要的作用。

三、发明内容

本发明的提供一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性引物SP2908及PCR检测方法，其利用RNA-seq技术，筛选出毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的一个特异表达基因并设计特异性引物，建立用于检测毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性PCR检测方法，为鸡毒害艾美耳球虫的临床检测应用和推广提供理论依据和技术支撑。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物序列如下：

SP2908-F：5’-GACAATCATACACACTGGGC-3’；

SP2908-R：5’-AGATGCCTCTTCCAAAGC-3’。

所述的特异性引物在检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中的PCR检测方法，其特征在于：所述的检测方法为：以待测样本的cDNA为模板，以特异性引物作为扩增引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现286bp目的条带，则待测样本为毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。

所述的PCR检测方法的步骤为：

(1)筛选确定鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异基因位点(ENH_00076120)及其cDNA特异性PCR扩增引物，特异基因序列、cDNA序列及其相应扩增引物序列见表1；