[发明专利]一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法

说明书

本发明公开一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法。该方法包括Foc1分生孢子悬浮液的制备、Foc1菌丝体的收集、菌丝体细胞壁的酶解、Foc1原生质体的收集、Foc1原生质体的再生等步骤。本发明通过所述方法酶解菌丝细胞，所获原生质体的制备数最高达到6.0×10⁸个/mL，所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形。本发明采用含有200g/L葡萄糖的CM固体培养基作为再生培养基，提高了Foc1原生质体的再生率，最高为28.6％，明显高于现有的香蕉枯萎病菌原生质体的再生方法，为后续原生质体转化技术研究香蕉病菌致病分子机制提供了良好的基础。本发明方法制备过程简单、高效，便于操作。

技术领域

本发明涉及的是细胞工程中丝状真菌原生质体制备与再生技术领域，具体涉及一种香蕉枯萎病菌1号小种(Foc1)原生质体的制备与再生方法。

背景技术

香蕉(Musa spp.)是热带亚热带最重要的水果之一，因其营养丰富、味道鲜美，深受人们喜爱。由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubence，Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害，被称为“香蕉癌症”，严重影响香蕉产业的健康发展。香蕉枯萎病是一种典型的维管束病害，可由Foc通过根部及受伤的地下球茎侵入植株，沿维管束向假茎及叶片蔓延，进而堵塞导管。危害我国香蕉的枯萎病菌主要有2个小种，即1号小种(Foc1)和4号小种(Foc4)。开展Foc致病相关基因功能研究，有利于全面阐明Foc的致病机理，也是有效防控香蕉枯萎病的基础。

利用原生质体进行的分子转化技术是开展丝状真菌基因功能研究的重要方法，而高效的原生质体制备与再生技术则是原生质体分子转化的基础。由于不同种类丝状真菌的细胞结构不同，尤其是细胞壁的结构和组成差异明显，因此制备丝状真菌原生质体的最佳条件也存在很大差异。目前，关于香蕉枯萎病菌原生质体制备的方法已有一些报道。例如，张磊等(2017)采用酶解法对Foc TR4原生质体进行了制备(25g/L崩溃酶、0.4g/L几丁质酶和15g/L溶解酶，酶解2h，菌丝与酶解液比例为1:15)，其原生质体产量约为2×10⁷个/mL(每毫升酶解液获得的原生质体个数)。张欣(2007)采用酶解法对Foc4原生质体进行了制备(10g/L的溶壁酶酶解3.5h，菌丝与酶解液比例为1:20)，其原生质体产量为3×10⁶个/mL，再生率为22％。谢德啸等(2012)采用酶解法对Foc4原生质体进行了制备(20g/L溶壁酶和20g/L崩溃酶酶解2h)，其原生质体产量为1×10⁶个/mL。整体上，关于香蕉枯萎病菌原生质体制备与再生方法的文献报道较少，大多直接参考了其它丝状真菌的制备与再生方法；且主要存在的问题在于原生质体制备效率较低，再生率不高。同时，也缺乏Foc1原生质体制备与再生方法的相关报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种高效的香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法。利用该方法使其原生质体的制备数最高达到6.0×10⁸个/mL，再生率最高达到28.6％。本发明可为香蕉枯萎病菌基因功能研究提供便利，也可适用于其它丝状真菌原生质体的高效制备与再生。本方法所获得的原生质体制备数和再生率均明显高于现有报道的香蕉枯萎病菌4号小种原生质体制备与再生的相关方法，也是首次报道香蕉枯萎病菌1号小种的原生质体制备与再生方法。同时，本发明制备原生质体所使用的酶解液还具有经济的特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，包括如下步骤：

(1)Foc1分生孢子悬浮液的制备：

将尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubence race 1，Foc1)接种于PDA培养基中培养；取菌丝块，加至查氏培养基中，震荡培养；将培养液用100～200目(优选200目)细胞筛过滤，离心，弃上清；用NCM培养基重悬沉淀并进行稀释，制得Foc1分生孢子悬浮液；