[发明专利]固定化酮还原酶突变体及其在制备度洛西汀手性醇中间体及其类似物中的应用

权利要求书

1.一种制备S-构型度洛西汀手性醇中间体及其类似物的方法，其特征在于，所述的方法利用固定化酮还原酶突变体作为催化剂，

所述的固定化酮还原酶突变体为酮还原酶突变体的固定化细胞或固定化酶，固定化酶是所述的突变体固定化于固相支撑物上；固定化细胞是所述的酮还原酶突变体表达于固定化于固相支撑物上的微生物细胞中；

所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述的酮还原酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述制备方法如下：在辅酶再生体系的存在下，固定化酮还原酶突变体催化剂催化度洛西汀手性酮基中间体及其类似物与度洛西汀手性醇基中间体及其类似物之间发生立体特异性平衡反应，反应式如下：

所述的方法，包括下列方法的任意一种：

(a)采用异丙醇和Im-Rr Kred进行反应，反应路线如下：

(b)采用葡萄糖结合葡萄糖脱氢酶Gdh进行反应，反应路线如下：

所述的转化反应体系中包括酮还原酶Rr Kred的固定化细胞或固定化酶、磷酸缓冲液、辅酶NADP、底物和辅酶再生底物异丙醇或葡萄糖；

其中，固定化细胞或固定化酶的用量在10-20g/200ml，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.5之间，辅酶浓度为0.01-0.05g/200ml之间，底物浓度在1-4g/200ml之间，辅酶再生底物浓度根据底物浓度进行调整。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化细胞的方法为采用壳聚糖对含酶细胞和戊二醛溶液进行交联，用无水碳酸钠进行制粒，过滤后得到固定化细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化酶采用戊二醛交联活化后的树脂，加入酶液连接到树脂上，最后用丙氨酸封闭树脂上的活性位点，获得固定在树脂上的酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为35-40℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的pH为7-11。