[发明专利]巫山淫羊藿及其易混物种的EST-SSR分子鉴定方法

权利要求书

1.一种鉴定巫山淫羊藿及其易混物种的EST-SSR引物组，其特征在于：

包括10对EST-SSR核心引物和通用M13引物；

引物C17的序列如SEQ ID NO.1和2所示，引物C37的序列如SEQ ID NO.3和4所示，引物C39的序列如SEQ ID NO.5和6所示，引物C43的序列如SEQ ID NO.7和8所示，引物C44的序列如SEQ ID NO.9和10所示，引物C48的序列如SEQ ID NO.11和12所示，引物C69的序列如SEQID NO.13和14所示，引物C78的序列如SEQ ID NO.15和16所示，引物C80的序列如SEQ IDNO.17和18所示，引物C90的序列如SEQ ID NO.19和20所示；

通用M13引物序列如SEQ ID NO.21所示。

2.巫山淫羊藿及其易混物种的EST-SSR分子鉴定方法，其特征在于包括下列步骤：

①用75%酒精清洁待测样品的叶片表面，然后利用CTAB法提取样品总DNA；

②以待测定样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的一种鉴定巫山淫羊藿及其易混物种的EST-SSR引物组进行PCR，PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix反应缓冲液5μL，10μM上、下游引物分别0.0125μL和0.25μL，M13-ROX/FAM/HEX/TAMRA接头引物0.15μL，稀释后的DNA模板 3μL，无菌水补至10μL；PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30s，退火温度从65℃降至50℃共15个循环每个循环降低1℃，再在50℃退火温度下做22个循环，50℃延伸30s，72℃终延伸42s，16℃保存；

所述的巫山淫羊藿及其易混物种包括金城山淫羊藿、镇坪淫羊藿、拟巫山淫羊藿和黔北淫羊藿；

③分析PCR扩增产物，9μL的PCR产物加入1μL10×DNA Loading Buffer充分混匀后，加至点样空，空加样孔中加入2μL 2000 DNA Marker，电泳30 min后，全自动凝胶成像分析系统观察扩增情况；观察到目的条带后进行以下操作：向带有HEX、FAM、ROX和TAMARE荧光基团的10μL PCR产物中，分别加入无菌水90μL，充分混匀后每板取5μL稀释液于无菌的96孔板中，加入80μL无菌水，充分混匀后取10μL混合液于30μL无菌水中充分混匀，取4μL稀释液于6μL HIDI溶液中，HIDI溶液使用前每1 mL加有1.8μL 的LIZ500内标，充分混匀后，ABI3730遗传分析仪检测；

④构建系统发育树，通过GeneMarker 2.4.0读取等位基因片段的长度，数据读取完成后在Excel表格中对数据进行修正，然后通过PowerMarker构建UPGMA树，鉴定待测样品所属的物种类群。

3.按权利要求 2所述的巫山淫羊藿及其易混物种的EST-SSR分子鉴定方法的应用，其特征在于：

将巫山淫羊藿及其易混物种金城山淫羊藿、镇坪淫羊藿、拟巫山淫羊藿和黔北淫羊藿进行鉴别。