[发明专利]用于植入的中脑多巴胺（DA）神经元

权利要求书

1.一种组合物，其包括与LDN-193189和CHIR99021接触的细胞群体，其中大于40％的所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(FOXA2)是阳性的，并且其中所述细胞群体预先与LDN-193189、SB431542、音猬因子(SHH)信号传导激活剂和CHIR99021接触，其中所述音猬因子(SHH)信号传导激活剂选自音猬因子(SHH)C25II和purmorphamine。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中大于10％的所述细胞群体选自对于叉头框蛋白A2(FOXA2)/LIM同源盒转录因子1,α(LMX1A)是双阳性的，以及对于叉头框蛋白A2(FOXA2)/orthodenticle同源盒2(OTX2)是双阳性的。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中至少20％的所述细胞群体对于选自Nurr1+、CD142、DCSM1、CD63和CD99的标记物是阳性的。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞群体选自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞和来自具有帕金森氏病(PD)神经系统症状的患者的人细胞。

5.一种诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方法，包括，

a)提供：

i)细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的非胚胎多能细胞和工程多能细胞；和

ii)第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、音猬因子(SHH)信号传导激活剂和第三信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂是SB431542，所述第二抑制剂是LDN-193189，所述音猬因子(SHH)信号传导激活剂选自音猬因子(SHH)C25II和purmorphamine，并且所述第三抑制剂是CHIR99021；

b)使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触，其中与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在能够产生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的48小时内发生，

c)在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖细胞群体分化的条件下，进一步使所述细胞与所述音猬因子(SHH)信号传导激活剂接触；和

d)在使所述细胞群体与所述音猬因子(SHH)信号传导激活剂接触之后，进一步使所述细胞与所述第三抑制剂接触，以使所述细胞群体分化成底板中脑祖细胞群体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞与所述音猬因子(SHH)信号传导激活剂的所述接触在能够产生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述音猬因子(SHH)信号传导激活剂的所述接触为至少24小时且至多36小时。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触在能够产生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细胞群体与所述音猬因子(SHH)信号传导激活剂接触之后，所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触为至少24小时且至多36小时。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述底板中脑祖细胞群体包括大于40％的叉头框蛋白A2(FOXA2)⁺LIM同源盒转录因子1,α(LMX1A)⁺细胞。

9.根据权利要求5所述的方法，还包括步骤e)使所述底板中脑祖细胞群体与神经元成熟培养基接触，所述培养基包括N2培养基、脑源性神经营养因子(BDNF)、抗坏血酸(AA)、胶质细胞系源性神经营养因子、二丁酰cAMP和β3型转化生长因子，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多巴胺(DA)神经元。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述底板中脑多巴胺(DA)神经元对于选自叉头框蛋白A2(FOXA2)/LIM同源盒转录因子1α(LMX1A)/酪氨酸羟化酶(TH)；叉头框蛋白A2/LIM同源盒转录因子1α/酪氨酸羟化酶/CD142；叉头框蛋白A2/LIM同源盒转录因子1α/酪氨酸羟化酶/核受体相关1蛋白(NURR1)；叉头框蛋白A2/LIM同源盒转录因子1α/酪氨酸羟化酶/CD142/核受体相关1蛋白和酪氨酸羟化酶/α-突触核蛋白的标记物组是阳性的。