[发明专利]一种AFFT1细胞的构建方法

权利要求书

1.一种AFFT1细胞的制备方法，其特征在于，所述AFFT1细胞的制备包括以下步骤：

1)筛选突变位点：通过对患者外周血进行ctDNA外显子测序，或者以患者肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点；

2)合成突变多肽：根据突变位点进行抗原表位预测，合成突变多肽；

所述抗原表位预测是以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，作为潜在抗原表位；分析潜在抗原表位的IC50，将IC50＜1000nM的潜在抗原表位确定为抗原表位；

3)获取AFF细胞：将外周血中的树突状细胞，采用TAX-GFP慢病毒进行感染，并选取理想的克隆作为永生DC，并负载所述突变多肽，与PBMC共孵育，获得AFF细胞；

4)获取精准多肽：用所述突变多肽作为抗原刺激所述AFF细胞，筛选获得精准多肽；所述精准多肽的评判标准：3) 设置阳性对照：T-cells+ 100 ng/mL OKT3；阴性对照：1640+10%FBS+200 U/mL IL2；阳性对照和阴性对照正常，则说明此数据可信；多肽作为抗原的以T-cells作为基线；每组实验为两个基线，高基线和低基线，两个基线的差异为系统误差；检测值高基线+系统误差即为有效的精准多肽；

5)获取AFF’细胞：以所述精准多肽负载DC细胞制备AFF’细胞；

6)以所述精准多肽作为抗原刺激所述AFF’细胞，筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性T细胞，通过测序得到特异性T细胞的TCRβ链CDR3区序列，并将已知的一对TCRβ链CDR3区替换成所述CDR3序列；

7)获取AFFT1细胞：敲除所述患者外周血T细胞中原有的TCR基因和表面免疫抑制性信号分子PD-1，并转入步骤6)中获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，制备得到AFFT1细胞。

2.权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述患者外周血替换为市售工程细胞系。

3.权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述工程细胞系为H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323 B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞或G422小鼠神经胶质瘤细胞。

4.权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述敲除患者外周血细胞的TCR基因和表面免疫抑制性信号分子的方法为CRISPR技术。

5.权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述表面免疫抑制性信号分子还包括： Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、2B4(CD244)、TIGIT。