[发明专利]一种HAFFT1细胞的构建方法

权利要求书

1.一种HAFFT1细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以精准多肽负载永生化DC细胞，并与PBMC共孵育，制备HAFF’细胞；以精准多肽作为抗原刺激HAFF’细胞，筛选获得能够识别所述精准多肽的特异性T细胞，通过测序得到特异性细胞的高频TCR，敲除原有TCR并进行高频TCR的表达，构建TCR-T细胞；将上述TCR-T细胞进行抑制性信号分子的敲除，制备得到HAFFT1细胞；

所述精准多肽的制备方法如下：

（1）通过对外周血进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测，合成突变多肽并进行小分子修饰；

将小分子（H）与多肽抗原（P）采用如下链接方式进行修饰（氨基端到羧基端：N-C）：H-P、P-H、H-P-H；

（2）将外周血中的树突状细胞，采用TAX-GFP慢病毒进行感染，并选取理想的克隆作为永生DC，并负载所述经小分子修饰过的突变多肽，与PBMC共孵育，获得HAFF细胞；

（3）用所述经小分子修饰过的突变多肽作为抗原刺激所述HAFF细胞，通过检查IFN-γ的分泌筛选获得精准多肽;

高频TCR的确定方法如下：以经过小分子修饰的精准多肽对HAFF’细胞进行刺激，对刺激后的细胞进行CD8、CD137、IFN-γ的染色，选择CD8+CD137+、或者CD8+IFN-γ+T细胞；提取基因组并对TCR进行测序分析，根据TCR分布频率，确定高频的TCR序列。

2.如权利要求1所述HAFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述患者外周血也可以是市售工程细胞系。

3.如权利要求2所述的HAFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述工程细胞系为H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC 小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323 B16F1、CRL-2539 4T1、U14 小鼠子宫颈癌细胞、BV-2 小鼠小胶质瘤细胞或G422 小鼠神经胶质瘤细胞。

4.如权利要求1所述HAFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述抗原表位的预测是以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，作为潜在抗原表位；分析潜在抗原表位的IC50，将IC50＜1000nM的潜在抗原表位确定为抗原表位。

5.如权利要求1所述HAFFT1细胞的构建方法，其特征在于，敲除原有TCR基因的方法为CRISPR技术。

6.如权利要求1所述HAFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、2B4（CD244）、TIGIT。