[发明专利]一种RFFT1细胞的构建方法

权利要求书

1.一种RFFT1细胞的构建方法，所述构建方法包括：S1)对肿瘤细胞进行全外显子测序；将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；以突变的氨基酸位点为中心预测抗原表位；采用多肽固相合成法合成突变多肽；PBMC细胞负载所述突变多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽，其中，所述精准多肽评判标准为：以FF细胞作为基线，设置两个独立重复，检测值高的为高基线，检测值低的为低基线；两个基线的差异为系统误差；检测值高基线+系统误差的实验组即为有效的精准多肽；S4)培养PBMC细胞，在培养过程中，用精准多肽进行多次多肽冲击；S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；S6)以精准多肽作为抗原刺激所得RFF细胞，筛选能够识别所述精准多肽的特异性细胞；S7)通过测序得到所述特异性细胞的TCRβ链CDR3区序列，由所述TCRβ链CDR3区序列扩增得到TCR基因；S8)培养PBMC细胞，敲除细胞中原有的TCR基因和表面免疫抑制性信号分子，并转入步骤S7中所得能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，制备得到RFFT1细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。

2.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，

所述肿瘤细胞来源于市售工程细胞系，包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。

3.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，

所述抗原表位的预测是以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，以一段21个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位。

4.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。

5.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。