[发明专利]一种LRFFT2细胞的构建方法

权利要求书

1.一种LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：

1)通过测序肿瘤细胞筛选出突变位点，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧各延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位，使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；

2)使用上步软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，将弱免疫原性的抗原表位连接在一起，合成连接后的突变多肽的基因序列；

3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；

4)使用所述慢病毒转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；

5)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，通过检测IFN-γ的分泌，筛选出有效的精准多肽；

6)以所述精准多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，对刺激后的细胞进行CD8、CD137、IFN-γ的染色，并以流式细胞仪进行分选，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，测序并得到特异性细胞的高频TCR基因；

7)利用CRISPR技术敲除外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，获得TCR-T细胞；

8)细胞表面免疫抑制性信号分子经抗体药物体外封闭，即得LRFFT2细胞。

2.如权利要求1所述的LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤1中测序是使用人源外周血或市售工程细胞系进行ctDNA测序，或者使用肿瘤组织进行全外显子测序。

3.如权利要求1所述的LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述市售工程细胞系包括：H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。

4.如权利要求1所述的LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤2中连接抗原表位的接头处IC50要高于两侧抗原表位的IC50。

5.如权利要求1所述的LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤5中抗原递呈细胞与PBMC以1：5-20的比例混合共培养。

6.如权利要求1所述的LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤6中以流式细胞仪进行分选，选择CD8+CD137+或者CD8+IFN-γ+细胞。

7.如权利要求1所述的LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述细胞表面免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、2B4(CD244)。

8.如权利要求1所述的LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述抗原递呈细胞包括：

外周血单个核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞。