[发明专利]一种鉴定山茶花色芽变品种的方法

权利要求书

1.一种鉴定山茶花色芽变品种的方法，其特征在于：鉴定方法具体如下：

步骤1，花色测定：采集山茶品种测定花色的L*、色相a*值、色相b*值、彩度C*值和色调角h，花色测定位置为花瓣上表皮中央部位，光源为C/2°；每样品测量5朵花的花色，数据列表，取平均值；

步骤2，定性分析：取山茶品种新鲜花瓣0.6 g，液氮研磨至粉末加提取液2 mL，浸提24h后用0.22 μm滤膜过滤，滤液保存在-20℃冰箱备用；

利用高效液相色谱–光电二极管阵列检测和超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱联用技术对花瓣中花青苷成分进行定性分析，联用技术采用超高效液相色谱系统和质谱系统，采用UNIFI 1.8软件系统，色谱柱为ACQUITY BEH C18 2.1 mm × 100 mm，1.7 μm；流速：0.3 mL·min^-1，进样量：2 μL，柱温40℃；以0.1%甲酸水溶液A和乙腈B为流动相，洗脱程序为0—1.5 min，5% B；1.5—11 min，5%—40% B；11—14 min，40%—95% B；14—16.5 min，95% B；16.5—16.8 min，95%—5% B；16.8—20 min，5% B；电喷雾电离离子源ESI，正离子模式，全离子扫描，扫描范围（m/z）：50-1200 u；脱溶剂气体为高纯度氮气，温度为450℃，流速为600 L·h⁻¹，毛细管电压为1 kV，锥孔电压为40 V；低能量扫描电压为6 eV，高能量扫描电压为20—45 eV；

根据UPLC–Q–TOF–MS图谱，检测到7种花青苷成分，根据Cy糖苷在513—520 nm 有特征吸收峰及碎片离子m/z 287，推测7种花青苷均为Cy型花青苷；

峰P1和峰P2质谱数据为分子离子m/z 449，碎片离子m/z 287，m/z 287是Cy苷元特征质荷比，根据峰P1和峰P2与标准品Cy3Ga和Cy3G共洗脱特性，及花青素半乳糖洗脱时间小于花青素葡萄糖苷特性；确定峰P1为矢车菊素–3–O–β–半乳糖苷，保留时间t_R为8.33 min，简称Cy3Ga，确定峰P2为矢车菊素–3–O–β–葡萄糖苷，保留时间t_R为9.43 min，简称Cy3G；

峰P3—峰P7的A₄₄₀/A_vis-max变化范围为32%—33%，确定其为3–O–糖苷类型；

峰P3—峰P7在311—316 nm波长下肩峰的出现推定化合物被芳香酸酰化；峰P3和峰P4质谱数据为分子离子m/z 611，碎片离子m/z 449，287；m/z 287为Cy苷元特征质荷比，m/z 611到m/z 449丢失162 u，m/z 449到m/z 287丢失162 u，推定其为Cy–3–O–咖啡酰型葡萄糖苷或半乳糖苷；

根据山茶中矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–咖啡酰]–β–半乳糖苷和矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–咖啡酰]–β–葡萄糖苷的报道及峰P3洗脱时间小于峰P4，判断峰P3和峰P4分别为矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–咖啡酰]–β–半乳糖苷和矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–咖啡酰]–β–葡萄糖苷；

峰P5、峰P6和峰P7质谱数据为分子离子m/z 595，碎片离子m/z 449，287；m/z 287为Cy苷元特征质荷比，m/z 595到m/z 449丢失146 u，m/z 449到m/z 287丢失162 u，推定其为Cy–3–O–p–香豆酰型葡萄糖苷或半乳糖苷；

根据山茶中矢车菊素–3–O–[6–O–(Z)–p–香豆酰]–β–葡萄糖苷、矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–p–香豆酰]–β–半乳糖苷和矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–p–香豆酰]–β–葡萄糖苷的报道，以及顺式花青苷洗脱时间小于反式花青苷及花青素半乳糖苷洗脱时间小于花青素葡萄糖苷特性，判断峰P5、峰P6和峰P7分别为矢车菊素–3–O–[6–O–(Z)–p–香豆酰]–β–葡萄糖苷、矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–p–香豆酰]–β–半乳糖苷和矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–p–香豆酰]–β–葡萄糖苷；

步骤3，定量分析：运用HPLC–DAD方法，在525 nm处检测花瓣中花青苷；采用标准品半定量法分别计算花瓣中含有的相对于标准品矢车菊素–3–O–β–葡萄糖苷的花青苷含量，重复3次；

采用分光色差仪对花色测定，CIE L^*a^*b^*体系中，L^*表示花色明暗变化程度；色相a^*值表示花瓣红、绿色变化，a^*为正值时数值越大，花色越红；色相b^*值表示花瓣黄蓝色变化程度；彩度C*表示色彩鲜艳程度，C*值越大，颜色越深；色调角h是对红、橙、黄、 绿、青、蓝、紫7种颜色色调描述；

白色、粉色和红色花瓣L^*值的平均值分别为89.46、72.49和56.70，随花色加深L^*值降低，花色明亮度降低；白色花瓣a^*值介于-0.51—-0.93，平均值为-0.69；粉色花瓣a^*值介于31.73—41.71，平均值为36.34；红色花瓣a^*值介于48.71—55.91，平均值为52.11；随花色加深a^*值升高，花瓣红色程度增加；白色花瓣b^*值介于1.65—6.53，平均值为3.97；粉色花瓣b^*值介于2.43—9.94，平均值为6.83；红色花瓣b^*值介于13.85—21.94，平均值为18.11；随花色加深b^*值升高，花瓣红色程度增加；白色、粉色和红色花瓣C*值平均值分别为4.07、35.09和51.69，随花色加深C*值升高，花瓣鲜艳程度增加；白色花瓣h值均处于90°—180°，平均值为98.93；粉色和红色花瓣h值均处于0°—90°，平均值分别为5.43和18.64；

提取液中甲醇：水：甲酸：三氟乙酸的体积比为70：27：2：1；

步骤3中标准品矢车菊素–3–O–β–葡萄糖苷和矢车菊素–3–O–β–半乳糖苷购于sigma公司，纯度≥98%。