[发明专利]一种MRFFT1细胞的构建方法

权利要求书

1.一种MRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

1）通过测序肿瘤细胞筛选出突变位点，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧各延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位，使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；

2）使用上步软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，使用弱免疫原性的接头将抗原表位连接在一起，合成连接后的突变多肽的基因序列；

3）构建表达所述突变多肽的MVA病毒载体，包装MVA病毒；

4）使用所述MVA病毒转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得MFF细胞；

5）所述突变多肽作为抗原刺激所述MFF细胞，通过检测IFN-γ的分泌，筛选出有效的精准多肽；所述精准多肽评判标准：设置阳性对照：T细胞+100 ng/mL OKT3；阴性对照：T细胞+1640+10%FBS+200 U/mL IL2；阳性对照和阴性对照正常，则说明此数据可信；实验组IFN-γ的释放量显著大于阴性对照组的为有效的精准多肽；

6）以所述精准多肽作为抗原刺激所述MFF细胞，对刺激后的细胞进行CD8、CD137、IFN-γ的染色，并以流式细胞仪进行分选，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，测序并得到特异性细胞的高频TCR基因；

7）利用CRISPR技术敲除外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步所述高频TCR基因，获得TCR-T细胞；

8）利用CRISPR技术敲除细胞表面免疫抑制性信号分子，即得MRFFT1细胞。

2.如权利要求1所述的MRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤1中测序是使用肿瘤患者人源外周血或市售工程细胞系进行ctDNA测序，或者使用患者肿瘤组织进行全外显子测序。

3.如权利要求2所述的MRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述市售工程细胞系包括：H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC 小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14 小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422 小鼠神经胶质瘤细胞。

4.如权利要求1所述的MRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤2中连接抗原表位的接头处IC50要高于两侧抗原表位的IC50。

5.如权利要求1所述的MRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤4中抗原递呈细胞与PBMC以1：5-20的比例混合共培养。

6.如权利要求1所述的MRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述抗原递呈细胞包括：外周血单个核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞。

7.如权利要求1所述的MRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤6中以流式细胞仪进行分选，选择CD8+CD137+或者CD8+IFN-γ+细胞。

8.如权利要求1所述的MRFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述细胞表面抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、2B4（CD244）。