[发明专利]一种LRFFT1细胞的构建方法

说明书

本发明使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效多肽，通过精准有效多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞；再利用TCR－T技术原理进行了改造；改造后的T细胞再用基因编缉技术对其进行免疫抑制靶点的敲除，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，得到更为攻防兼备的LRFFT1细胞。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LRFFT1细胞的构建方法。

背景技术

目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGE A3抗原。

以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤免疫微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢病毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。特异性精准多肽的二次刺激不如T细胞受体转导的肿瘤特异性抗原更直接。现有的TCR-T在治疗血液肿瘤和实体肿瘤的解决方案中，缺乏覆盖更多瘤种的精准的TCR。

上述方案均没有考虑T细胞的自我防护技术，使得数量不多的特异性T细胞直接面对强大的肿瘤免疫微环境。普遍缺乏对患者抗原也缺乏准确有效的分析。

发明内容

本发明使用患者外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效多肽，通过精准有效多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞；再利用TCR－T技术原理进行了改造；改造后的T细胞再用基因编缉技术对其进行免疫抑制靶点的敲除，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，得到更为攻防兼备的LRFFT1细胞。

本发明提供的LRFFT1细胞可广泛应用于个体化精准治疗实体肿瘤。

对于专用名词的解释：

L：慢病毒转染技术

R：精准多肽二次冲击技术

FF：混合多肽技术

T：TCR-T技术

1：靶点敲除防护技术

例如：LRFFT1细胞，即经由上述L、R、FF、T、1各项技术方案或技术手段改造而最终获得的细胞。

LRFFT1细胞改造方案概述如下：

1、抗原表位预测