[发明专利]一株稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系及应用

说明书

本发明公开了一株稳定表达A亚群禽白血病病毒(ALV‑A)gp85蛋白的细胞系及应用。所述的稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系，命名为293F‑Agp85，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC NO.17420。实验证明，该细胞系可以高效稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白，其表达量高达25mg/L。此外，通过与细胞受体Tva互作和结合试验结果表明，由本发明细胞系表达获得的ALV‑A gp85蛋白具有正常的生物学活性，能够与细胞受体正常结合，并没有影响其生物学活性，且由于其表达量高，不需要转染，成本低，在体外研究ALV‑A感染细胞的机制和建立抗体检测方法等防控技术领域将具有良好的应用前景和意义。

技术领域

本发明涉及一株稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系，还涉及 由该细胞系表达获得的蛋白及应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引 起的禽类多种具有传染性的良性和恶性肿瘤性疾病的总称。根据宿主范围、病毒 囊膜基因以及血清学交叉反应性的不同，ALV被划分为A-J 10个亚群，近些年 在我国又出现了新的亚群，指定为K亚群。根据病毒传播方式的不同，ALV可 分为内源性病毒和外源性病毒，其中E亚群为内源性病毒，A-D，J和K亚群为 外源性病毒。内源性病毒一般致病性低甚至无致病性，而ALV的临床肿瘤几乎 都是由外源性病毒感染所引起。A亚群禽白血病病毒(ALV-A)致病性较强，主 要引起蛋用型鸡的淋巴细胞白血病，主要引起鸡群生产性能下降以及感染鸡产生 肿瘤导致鸡的死亡，对养禽业危害严重。

ALV属于α-反转录病毒属，具有典型禽反转录病毒的基因组结构，为有囊膜 的RNA病毒。编码区包括gag，pol和env基因，gag基因编码核心蛋白，pol基 因编码酶蛋白，env基因编码囊膜糖蛋白。env是由表面蛋白gp85(SU)和跨膜蛋 白gp37(TM)组成的异源二聚体。gp85蛋白含有病毒-受体决定簇，能够识别宿主 细胞膜上的特异性受体，决定亚群特异性以及宿主的范围。因此，得到有生物学 活性的纯化的gp85蛋白，对于体外研究ALV-A感染细胞的机制和建立抗体检测 方法等防控技术至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一株稳定表达ALV-A gp85蛋白的细胞系，以及由该细 胞系表达获得的gp85蛋白及应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

为了能得到高效表达的ALV-A gp85蛋白，本发明发明人选取RAV-1(ALV-A) gp85基因第1-1020bp的序列，进行密码子优化并合成，优化后的ALV-A gp85基 因序列如SEQ IDNO.1所示，优化后的序列上游添加信号肽序列，下游携带His 标签。序列两端分别为BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点。将此序列双酶切后， 胶回收，酶切产物用T4连接酶连接到同样经BamHⅠ和XhoⅠ酶切的慢病毒 表达载体pLVX，构建重组质粒pLVX-A-Tgp85。293T细胞在含10％胎牛血清的 DMEM培养基中，于37℃和5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。待细胞生长至85％密度时，将0.1％PEI、质粒pLVX-A-gp85按照3：1的比例加入到无血清培 养基中，培养，收集细胞上清作为包装好的病毒液。293F细胞在无血清、2％青 链霉素混合液、1％谷氨酰胺293M无血清培养基中，于37℃和5％CO₂饱和湿度 的摇床培养箱中培养。加入包装好的病毒液至293F细胞中继续培养，收集稳定 转染pLVX-A-gp85质粒的分选后的293F细胞上清，进行纯化。使用Western Blot 和SDS-PAGE电泳检测gp85蛋白表达情况。结果发现，该细胞系可以高效稳定 的表达ALV-A gp85蛋白，其蛋白表达量为25mg/L，且遗传稳定性良好。通过与 细胞受体Tva互作和结合试验结果表明，通过稳定表达的方式制备的ALV-Agp85 蛋白具有正常的生物学活性，能够与细胞受体正常结合，并没有影响其生物学活 性。