[发明专利]一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用

说明书

本发明提供了一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用，所述HBB过表达载体包括HBB表达模块；所述HBB表达模块包括串联放置的DNase I核心高敏位点、启动子、HBB表达框和下游高敏位点；所述DNase I高敏位点包括串联表达的HS4、HS3、HS2和3’E等；所述HBB表达模块的总长度小于4kb。本发明通过精简和优化顺式作用元件和HBB表达框，不仅显著缩短了HBB表达模块的长度，而且提高了HBB表达模块的转录激活强度，实现了HBB珠蛋白基因的高效稳定特异性激活。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种载体及其设计方法和应用，尤其涉及一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用。

背景技术

β-地中海贫血是由于β-珠蛋白基因座(HBB，β-globin)发生碱基替代、缺失、删除、倒位等基因突变，造成β-珠蛋白肽链生成障碍或异常，引发合成不足或完全缺乏，使得血红蛋白α、β两种亚基比例失衡，患者不能形成功能性血红蛋白，同时导致溶血性贫血，使机体氧气供应严重不足，重者危及生命。在我国，地中海贫血已成为长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一。我国南方地区的地中海贫血基因缺陷率为2.5％～20％，其中广东省地中海贫血基因缺陷发生率高达10％，每9个人就有1人携带地中海贫血基因，携带率高达8.5％，全省地中海贫血的病例数占全国总数的1/5，每年平均新增4000例地贫。

基因治疗被认为是下一代临床治疗的终极手段。基因治疗(Gene Therapy)是指将外源DNA片段导入靶细胞，以纠正、修复、替换、补偿或沉默等方式对缺陷和异常基因进行针对性干预，以期恢复正常的基因功能，最终达到治疗甚至完全治愈的目的。目前国际上通过慢病毒载体过表达HBB(成人β-globin)的策略开展β-地中海贫血的基因治疗已经进入临床III期试验，即将进入上市前准备。

慢病毒是来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的一种转基因载体，不需要经历细胞分裂和细胞核膜破裂过程，就可以进入细胞核，将RNA基因组反转录后整合到宿主基因组上，对分裂细胞和非分裂细胞都具有感染能力，从而使得向造血干细胞(HSC)中进行基因转导的效率大幅度提高。

利用慢病毒技术治疗地中海贫血策略为1)分离和纯化地中海贫血患者的造血干细胞；2)构建并包装过表达HBB的慢病毒颗粒；3)HBB慢病毒体外感染造血干细胞；4)自体造血干细胞移植。

目前国际同行已经开发出多种β-地中海贫血基因治疗载体，如HPV56、BB305、GLOBE等，主要构建策略为根据β-珠蛋白基因簇的调控元件特征，将相关核心顺式元件与HBB基因表达框串联，组装成精简的HBB表达模块，反向装载到慢病毒载体上；慢病毒转导HSC后，其装载的表达模块将随机插入整合至HSC基因组中；在HSC向红系分化过程中，红系特异转录因子将识别并结合逐渐开放的顺式元件及HBB启动子区域，激活外源性HBB基因的强力表达。如图1所示为BB305载体，作为最成功的一种HBB慢病毒载体，已广泛应用于临床试验中。

当前国际上有多项相关临床试验正在进行。其中，美国蓝鸟公司(Blue Bird)以BB305载体为骨架生产的慢病毒药物LentiGlobin的II期或III期临床试验结果振奋人心。2017年，BB305载体首次用于治疗镰刀型贫血症，结果发现，基因转导的HSC在分化为红细胞后，血红蛋白的异常聚集明显降低，疗效显著。2018年，NEJM再次报道了该团队的II期临床试验结果(HGB-204和HGB-205)：22位输血依赖的地贫患者，通过LentiGlobin基因治疗后，在长达3年的观测中，有15位不再需要进行输血治疗，其余还需输血的患者其输血量和输血次数也大大降低。在最近的第60届美国血液学年会(ASH)上，蓝鸟公司公布了最新的III期临床结果(HGB-207和HGB-212)，在11位患者中有10位不再需要输血治疗。