[发明专利]低温VSW3 RNA聚合酶体外转录合成全长无中断cas9 mRNA的应用

说明书

本发明公开低温VSW3 RNA聚合酶体外转录合成全长无中断cas9 mRNA的应用，所述VSW3 RNA聚合酶体外转录合成全长无中断cas9 mRNA的过程包括以下步骤：(1)构建含VSW3 RNA聚合酶特异性启动子的cas9质粒；(2)PCR法制备转录模板；(3)VSW3 RNA聚合酶转录合成加帽cas9 mRNA；(4)模板DNA消除和mRNA加尾；运用VSW3 RNA聚合酶在低温下转录合成cas9 mRNA不仅能够提高RNA产物的稳定性，更重要的是该酶转录合成cas9 mRNA无中断RNA产物，提高了全长RNA的纯度，省掉分离除去中断RNA产物纯化步骤，减少纯化过程造成的损失，在保证RNA纯度的前提下提高cas9 mRNA产量，是满足cas9 mRNA大量合成需求，且能保证质量和降低生产成本的最佳选择。

技术领域

本发明属于长链RNA合成研究生产领域，具体涉及基因编辑工具cas9 mRNA的合成，应用低温VSW3 RNA聚合酶在体外可以高效的转录合成全长无中断cas9 mRNA，克服了目前通用的T7 RNA聚合酶转录合成cas9 mRNA时不可避免地发生中断的问题，显著提高产物纯度和产量，从而有效降低生产成本。

背景技术

最近几年，随着小RNA、mRNA、长链非编码RNA、RNA适配体、核酶等RNA研究技术的飞速发展，RNA在生物学上越来越受到重视(Burnett J C.，2012)。越来越多的生物学研究和应用需要用到大量的RNA，质量和纯度要求也越来越高，其中各类mRNA的需求成倍增加，其中最具代表的是广泛运用于基因编辑的cas9 mRNA。CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法(Hsu PD，2014)。

2013年，来自麻省理工学院，哈佛医学院，Broad研究院等处的研究人员和青年华人学者张峰完成了人类细胞全基因组范围内CRISPR-Cas9敲除筛选，这对于CRISPR-Cas9技术的发展具有重要意义(Ran FA，2013)。作者通过用慢病毒载体构建CRISPR-Cas9敲除(GeCKO)文库，在基因组范围内，能靶向18080个基因(64，751个独特靶向序列)进行敲除。此项技术立即用于药物的靶点筛选，并再新药筛选中，取得喜人的突破(Shalem O，2013)。以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。目前，该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰(Yuxuan Wu，2017；Ling Li，2019)；与此同时，越来越多的RNAs开始作为药物分子进入临床实验阶段，有的已经被FDA批准上市，作为药物运用于临床无疑对RNA产品的质量也提出了更高的要求(Dowdy S F.，2017)。

目前，包括cas9基因在细胞内的表达基本都是通过含有该基因序列的表达载体转染到细胞中进行复制并转录成mRNA，最终翻译表达为目的蛋白。但是与目的基因真核表达质粒相比，直接向细胞内转入mRNA有明显优势。首先，转染mRNA比质粒DNA安全，没有质粒DNA可能整合到基因组中的风险；其次，质粒在细胞内长期存在，持续表达目的蛋白会造成脱靶效应风险提高。所以，如果我们只是想表达某种蛋白，在达到研究或治疗目的后，这种蛋白能很快被细胞代谢降解，直接转入mRNA无疑是最好的选择。因为mRNA翻译成目的蛋白的半衰期在2-4天左右，这为很多蛋白和酶包括cas9在细胞内实施基因编辑功能留下了足够效用时间(R.Alexander，2018)。