[发明专利]携带CTTNBP2NL基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及在制备抗肿瘤药物中的用途

说明书

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种携带CTTNBP2NL基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用，该CTTNBP2NL基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。重组溶瘤痘苗病毒的构建方法包括两个步骤：(A)将CTTNBP2NL的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB‑TTL质粒；(B)pCB‑TTL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得携带CTTNBP2NL基因的溶瘤痘苗病毒。本发明的溶瘤痘苗病毒不仅对多种肿瘤细胞具有显著抑制效果，而且显著提高了溶瘤痘苗病毒在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤能力，在抑制肿瘤生长以及延长荷瘤小鼠生存时间上都得到了体现，为肿瘤的病毒治疗提供了新的靶点，具备广阔的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种携带皮层蛋白结合蛋白2N端样蛋白(Cortactin-binding protein 2N-terminal-like protein,CTTNBP2NL)基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。

背景技术

溶瘤病毒是指能够选择性感染并损伤肿瘤组织的有治疗价值的病毒。溶瘤病毒有着悠久的历史，至今已有分属10个病毒家族的溶瘤病毒进入临床试验，包括腺病毒(Adenovirus)、柯萨奇病毒(Coxackie virus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、细小病毒(Parvovirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)与水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)。目前已有疱疹病毒T-VEC被FDA批准治疗黑色素瘤。总体上，溶瘤病毒在临床试验中表现出了可观的安全性和有效性。

痘苗病毒是痘病毒家族中的大双链DNA病毒，相比其他溶瘤病毒有以下几个优点：(1)其在DNA病毒中是独一无二的，因为它只在细胞质中复制，以尽量减少整合在宿主基因组内的风险；(2)痘苗病毒最早被制成疫苗来对抗天花病毒，其安全性有较大的保障；(3)痘苗病毒的克隆能力大，可以允许较大长度的基因片段的插入；(4)病毒复制能力强。

溶瘤痘苗病毒已经表现出抗肿瘤效力。目前常见的溶瘤痘苗病毒大都经过减毒改造，包括胸腺嘧啶激酶TK基因缺失或TK/痘苗病毒生长因子基因双缺失的病毒株等。TK基因的缺失使痘苗病毒的复制更依赖于细胞内的TK水平，而癌细胞相比于正常细胞往往具有更高水平的TK；另外，痘苗病毒的复制还依赖于表皮生长因子受体EGFR/Ras通路的驱动，从而使其对癌细胞具有很强的选择性。溶瘤痘苗病毒在实验动物和人体上均表现出向癌组织靶向性聚集的能力，因此已成为癌症治疗的理想病毒载体。

已有研究表明CTTNBP2NL参与纹蛋白互作磷酸酶与激酶(Striatin interactingphosphatases and kinases,STRIPAK)复合体的组成(Goudreault,M.,L.M.D'Ambrosio,etal.2009.A PP2A phosphatase high density interaction network identifies anovel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to thecerebral cavernous malformation 3(CCM3)protein.Mol Cell Proteomics 8(1):157-171.)，但对其功能还所知甚少。本研究组此前将CTTNBP2NL的基因克隆到非复制型腺病毒载体上，构建了Ad-CTTNBP2NL重组腺病毒。相比于病毒载体，Ad-CTTNBP2NL可显著抑制肿瘤细胞的体外增殖，表明CTTNBP2NL基因的外源表达对肿瘤细胞可以产生一定的细胞毒性作用(赵珍珍，携带CTTNBP2NL基因的重组腺病毒的抗癌研究，浙江理工大学硕士学位论文，2017)。然而，作者并未通过后续动物实验进行进一步验证，该重组腺病毒是否在动物实验中对肿瘤细胞也具有疗效并未可知，因此，根据该实验结果还无法判断CTTNBP2NL基因是否能应用到肿瘤治疗上。