[发明专利]一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体有效
申请号: | 201910440487.8 | 申请日: | 2019-05-24 |
公开(公告)号: | CN110106153B | 公开(公告)日: | 2020-12-29 |
发明(设计)人: | 方芳;周景文;杨涛;徐洁;陈坚;堵国成 | 申请(专利权)人: | 江南大学 |
主分类号: | C12N9/02 | 分类号: | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;A23L5/20;A23L27/50 |
代理公司: | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人: | 彭素琴 |
地址: | 214000 江苏*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 耐盐性 提高 氧化酶 突变体 | ||
本发明公开了一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体。本发明通过定点突变将野生型多铜氧化酶WT的第317位苏氨酸突变成天冬酰胺、第386位亮氨酸突变成酪氨酸、第427位丝氨酸突变成谷氨酸,构成突变体T317N‑L386Y‑S427E。T317N‑L386Y‑S427E较WT相比,对6%、9%、12%、15%、18%NaCl(W/V)的耐受性均有所提高。
技术领域
本发明涉及一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体,尤其是一种耐盐性提高的解淀粉芽孢杆菌来源的多铜氧化酶突变体,属于生物工程技术领域。
背景技术
生物胺是一类具有生物活性的低分子量的含氮有机物的总称,是生物体内正常的生理活性物质。人体自身合成的适量的生物胺有助于维持机体正常的生理功能,但是,通过食物摄入过量生物胺时,会引起头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应,严重时危及生命。
生物胺广泛存在于乳制品、水产品、肉制品、果汁、调味品等蛋白质含量比较丰富的发酵食品以及含酒精发酵饮品中。除了食品中本身所含有的生物胺以外,发酵食品中的生物胺大多是经过氨基脱羧作用形成的。食品中丰富的蛋白质在内肽酶和外肽酶的共同作用下分解为氨基酸,在对应的氨基酸脱羧酶的催化下,氨基酸氧化生成生物胺。食品中常见的生物胺主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺和组胺等。生物胺中毒性最大的是组胺,其次是酪胺。
随着生活水平的提高,人们对食品安全的要求越来越高,而生物胺的潜在毒性作用对人体健康构成的危害不容小觑,因此应采取有效措施进行控制和减少。目前,食品中生物胺含量的控制主要从三个方面着手:(1)从源头控制:①食品中的生物胺大多是经过氨基脱羧作用形成的,控制游离氨基酸的含量,可以减少生物胺的含量,然而,食品中游离氨基酸主要是原料中蛋白质水解的产物,控制游离氨基酸的含量就意味着要减少蛋白质的含量,这样做会影响某些高蛋白食品的风味;②采用无氨基酸脱羧酶活性的菌株代替原生产菌种,在发酵一开始就加入到发酵体系中,但是,由于混菌发酵和开放发酵的原生产菌株种类多且关系复杂,替代其中一个菌株可能会造成整个发酵体系的改变,最终导致发酵失败,所以这种控制方式一般仅适用于封闭的单菌发酵体系。(2)过程控制:①通过对生产过程中的原料、温度和盐度进行合理选择,抑制生物胺产生菌的生长,以达到抑制生物胺产生的目的;这种方法的局限性在于加工温度和盐度等因素多由食物特性决定,而低温贮藏会提高设备和能耗费用,且有些微生物低温下也能产生生物胺;②在发酵过程中添加降解生物胺的菌株,在不影响发酵体系中的用于生产的优势菌株的情况下,降解发酵过程中产生的生物胺,但,这种方法的局限性在于人们担心添加菌株的安全性以及可能会影响食物风味。(3)末端消除:通过向发酵食品中添加生物胺降解酶来降解食品中已经形成的生物胺,这种方法基本不影响发酵食品的生产工艺,且对食品营养和风味的影响也较小,是目前最具应用前景的方法。
关于生物胺降解酶,有研究者尝试从筛选得到的能够降解生物胺的菌株中分离纯化出具有分解生物胺能力的酶,并对酶的作用机制进行了初步分析。胺氧化酶、胺脱氢酶和多铜氧化酶是目前主要的三类具备降解生物胺能力的酶。可降解生物胺的胺氧化酶和组胺脱氢酶只能特异性地作用于某种或某几种生物胺,且酶的活性还受乙醇或羰基化合物的抑制,同时,酶的最适pH多为中性,因此,当应用这两类酶降解含酒精的发酵饮品以及酸性发酵食品中的生物胺时,难以取得理想的效果。多铜氧化酶可催化多种生物胺氧化生成对应的醛、氨和水,其活性受酸性环境以及乙醇影响较小,但,高盐发酵食品(例如酱油含盐18%)中的高盐环境会使酶很快失活从而影响了酶对生物胺的降解效果。因此,提高多铜氧化酶的耐盐性对于建立发酵食品中生物胺的酶法减控方法具有重要的意义。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体及其制备方法。所述耐盐性是指多铜氧化酶对NaCl的耐受能力,所述耐盐性提高是指多铜氧化酶对NaCl的耐受能力提高。
[技术方案]
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