[发明专利]携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途

说明书

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途，该海绵凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。重组溶瘤痘苗病毒的构建方法包括两个步骤：(A)将AVL的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB‑AVL质粒；(B)pCB‑AVL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒。本发明的溶瘤痘苗病毒oncoVV‑AVL对乳腺癌细胞、肝癌细胞、结直肠癌细胞以及胶质瘤细胞的体外抑制效果显著，且呈剂量依赖，同时对多种肿瘤动物模型也具有显著的治疗效果，因此本发明显著提高了溶瘤痘苗病毒在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤能力。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。

背景技术

溶瘤病毒是指能够选择性感染并损伤肿瘤组织的有治疗价值的病毒。自1991年首次报导胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinase,TK)缺失的单纯疱疹病毒(Herpes simplexvirus,HSV)用于治疗鼠胶质母细胞瘤以来，至少已有分属10个病毒家族的溶瘤病毒进入临床试验，包括腺病毒(Adenovirus)、柯萨奇病毒(Coxackie virus)、单纯疱疹病毒、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、细小病毒(Parvovirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)与水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)。总体上，溶瘤病毒在临床试验中表现出了可观的安全性和有效性。

痘苗病毒是一种有被膜的双链DNA病毒，因具备全身用药稳定、瘤内快速复制和扩散、外源基因容量大以及多年来用作消除天花的疫苗表现出的安全性，从而成为一种理想的溶瘤病毒载体。进入临床前和临床试验的溶瘤痘苗病毒(oncolytic vacciniavirus,oncoVV)队伍正在日益增长。

目前常见的溶瘤痘苗病毒大都经过减毒改造，包括胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase，TK)基因缺失或TK/痘苗病毒生长因子基因双缺失的病毒株等。TK基因的缺失使痘苗病毒的复制更依赖于细胞内的TK水平，而癌细胞相比于正常细胞往往具有更高水平的TK；另外，痘苗病毒的复制还依赖于表皮生长因子受体EGFR/Ras通路的驱动，从而使其对癌细胞具有很强的选择性。痘苗病毒的几个特征还有助于它们在癌组织间的传播，例如，细胞外痘苗病毒的被膜有助于广泛扩散而且抵御中和抗体的攻击，而细胞内痘苗病毒的肌动蛋白尾巴则可帮助病毒进入邻近的癌细胞。溶瘤痘苗病毒在实验动物和人体上均表现出向癌组织靶向性聚集的能力。

海绵凝集素(Aphrocallistes vastus lectin，AVL)(GenBank:AJ276450.1)是一种钙离子依赖的C型凝集素，具有特异结合D-半乳糖的能力(Gundacker,D.,S.P.Leys,etal.(2001).Isolation and cloning ofa C-type lectin from the hexactinellidsponge Aphrocallistes vastus:aputative aggregation factor.Glycobiology 11(1):21-29.)。在海绵中发现的凝集素见于抗HIV的应用研究。目前尚未见将AVL应用于制备抗肿瘤药物的相关研究，也尚未见将海绵凝集素基因与溶瘤痘苗病毒重组协同进行抗肿瘤的研究。

发明内容

本发明是为解决上述技术问题进行的，通过将海绵凝集素基因与溶瘤痘苗病毒进行结合，达到了对荷瘤小鼠更优的治疗效果，因而提供一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。

本发明的第一方面提供了一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒，该溶瘤痘苗病毒携带海绵凝集素基因，海绵凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示：