[发明专利]一种基于排除分子间二硫键干扰特异检测多肽药物的方法

说明书

本发明提供一种基于排除分子间二硫键干扰特异检测多肽药物的方法。所述方法包括添加硬脂酸酰亚胺来封闭多肽样品中的自由巯基，然后添加聚乙醇钠来封闭所述多肽中的分子间二硫键，从而避免其在检测多肽的过程中造成干扰。本发明的方法简单、有效，具有很高的检测灵敏度和准确度，从而具有良好的成本效益。

技术领域

本发明涉及多肽药物检测领域，更具体地涉及能够在排除分子间二硫键干扰的情况下特异性检测多肽的方法。

背景技术

多肽药物是介于传统的化学药物和大分子药物纸件的一种特殊药物，是近年来药物开发的热点之一。其具有毒副作用低、用量少、生物活性强、疗效好等特点。现在全球已上市的合成类多肽药物有60多种，国内药典中收录的合成多肽类药物有30多种。多肽药物的剂型多为注射型和注射用粉针，也有一些新型剂，如注射用微球、缓释剂、喷鼻剂等。

在多肽合成中，两个半胱氨酸残基侧链之间形成的二硫键在维持多肽和蛋白质的空间构象以及由此决定的生物活性中发挥着重要作用。在合成时，由于多肽分子量较大，空间结构较为复杂，它要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。

然而，在检测多肽时，由于二硫键的存在，在传统的生物素转换过程中，二硫键也会同时被还原，从而对多肽的检测造成干扰。

为此，在本领域中，仍然需要一种能够在避免分子间二硫键干扰的情况下对多肽进行特异性检测的方法。

发明内容

．要解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明旨在避开分子间二硫键干扰而对多肽进行特异性检测。

．技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案。

在一方面，本发明提供一种基于排除分子间二硫键干扰特异检测多肽药物的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：准备待检测的多肽样品，并且利用含有0.4%乙醇的水杨酸溶液进行预处理，以消除部分杂质并调节多肽至pH 4-6；步骤2：向步骤1获得的溶液中添加硬脂酸酰亚胺来封闭多肽样品中的自由巯基；步骤3：通过加酸清除步骤2中过量的硬脂酸酰亚胺，然后向步骤2中获得的溶液中添加聚乙醇钠来封闭所述多肽中的分子间二硫键；步骤4：除掉未结合的封闭试剂，使用0.4%碳酸氢钠将溶液pH调节至7-9，然后使用特异性还原试剂将被修饰的多肽半胱氨酸巯基还原成自由巯基；步骤5：向步骤4中获得的溶液添加可逆性巯基标记试剂来标记多肽中的自由巯基；和步骤6：对其中的自由巯基进行标记的多肽进行亲和纯化，然后进行高效液相色谱和质谱鉴定。

根据前述方面所述的方法，其中所述多肽选自谷胱甘肽、亮丙瑞林、替可克肽、艾塞那肽中的一种或多种。

根据前述方面所述的方法，其中在步骤4中的特异性还原试剂选自抗坏血酸钠和次硫酸钠。利用所述特异性还原试剂，能够将多肽中的含硫基团还原成-SH，以便于后续进行标记。

根据前述方面所述的方法，其中在步骤5中的可逆性巯基标记试剂选自生物素苯磺酸酰亚胺、生物素硬脂酰亚胺、N-碘异丙酰生物素戊二胺和同位素亲和标签试剂。

根据前述方面所述的方法，其中在步骤1中将溶液的pH调节至5。

．有益效果

相比于现有技术，本发明的优点在于：

（1）通过采用本发明所述的方法，有效地消除了多肽检测过程中的二硫键干扰，从而提高了多肽检测的灵敏度和准确性。不拘泥于任何理论，本发明人在实验中发现，通过向溶液中添加聚乙醇钠，能够有效封闭多肽中的二硫键，从而避免其在随后的还原过程中被还原，从而有效消除其对多肽检测的干扰。

（2）在本发明的方法中，不使用不可逆性巯基标记试剂，从而避免对多肽中的自由巯基标记的干扰。

（3）本发明的方法简便实用，具有非常良好的成本效益。