[发明专利]一种食源性致病菌单增李斯特菌PCDR法检测试剂

说明书

本发明涉及食源性致病菌单增李斯特菌PCDR法检测试剂，可有效解决高灵敏度PCDR法快速、准确检测食源性致病菌单增李斯特菌的问题，方法是，由以下组分：SD缓冲液、dNTPs、Mg2+、1对上、下游内引物、1对上、下游外引物，SD DNA聚合酶，加超纯水混匀制成；使用时：将单增李斯特菌的基因组DNA溶解在ddH₂O中，取DNA和本发明检测试剂混合在一起，在EP管中混匀；将反应管放置于PCR仪中反应、预变性、退火、延伸，循环，再琼脂糖凝胶电泳检测，即可实现PCDR法对食源性致病菌单增李斯特菌的检测。本发明组分科学合理，易生产制备，使用方便，能够快速、灵敏、特异性检测食源性致病菌单增李斯特菌，确保食品安全，有显著的经济和社会效益。

技术领域

本发明涉及食品安全领域，特别是一种食源性致病菌单增李斯特菌PCDR法检测试剂。

背景技术

随着食品工业的蓬勃发展，食品种类和数量不断增多，特别是近年来由食源性致病菌引起的食品安全事件频发，一次次给人们敲响警钟，越来越迫切需要对食源性致病菌进行高效、快速、准确的检测。食源性致病菌单增李斯特菌（即单核细胞增生李斯特氏菌）的传统检测方法涉及到前增菌、选择性分离培养、生化实验和血清学鉴定，存在检测周期长、操作繁琐、特异性低等诸多缺点。所以国家一直重视对食源性致病菌检测方面的研究，希望通过分子生物学技术，找到特异性强、灵敏度高、省时省力的检测技术，这对人们的生命健康有着重要的实际意义。

聚合酶链置换反应(PCDR)是一种在经典PCR技术上的改进技术，利用SD DNA聚合酶可使用超过一对巢式引物进行扩增。研究发现，其反应速度和灵敏度都超过常规PCR。本发明主要研究用PCDR法检测单增李斯特菌，针对目的基因设计两对巢式引物，并对反应体系进行了探索，而提供一种食源性致病菌单增李斯特菌PCDR法检测试剂，并给出检测方法，但至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种食源性致病菌单增李斯特菌PCDR法检测试剂，可有效解决高灵敏度PCDR法快速、准确检测食源性致病菌单增李斯特菌的问题。

本发明解决的技术方案是，一种食源性致病菌单增李斯特菌PCDR法检测试剂，是由以下组分：SD缓冲液、dNTPs、Mg2+、1对上、下游内引物、1对上、下游外引物，SD DNA聚合酶，加超纯水混匀制成；

所述的SD DNA聚合酶是Taq酶的改造产品，具有耐热性和链替换能力，适于PCR扩增高GC和有2级结构的DNA，尤其可扩增超过20kb的大片段DNA，这是由于其链置换活性， stranddisplacement activity，可采用现有市售产品，如德国 Bioron公司生产的 SD DNA聚合酶（http://www.gzailisisw.com/index.php m=Product&a=show&id=86）；

所述的1对上、下游内引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的引物，1对上、下游外引物的核苷酸序列SEQ ID No:1和SEQ ID No:2，均来自于食源性致病菌单增李斯特菌的hemolysin基因；

该试剂使用时：将单增李斯特菌的基因组DNA溶解在ddH₂O中，取DNA和本发明检测试剂混合在一起，在EP管中混匀；将反应管放置于PCR仪中反应、预变性、退火、延伸，循环，再琼脂糖凝胶电泳检测，即可高效、快速、准确的实现PCDR法对食源性致病菌单增李斯特菌的检测。

本发明组分科学合理，易生产制备，使用方便，能够快速、灵敏、特异性检测食源性致病菌单增李斯特菌，确保食品安全，是食源性致病菌单增李斯特菌检测上的一大创新，有显著的经济和社会效益。

附图说明

图1为本发明的内、外引物在目的基因中的位置图。

具体实施方式