[发明专利]条件性敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法

权利要求书

1.一种条件性敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法，其特征在于，通过基因工程技术对C57小鼠进行基因改造，构建出FLOX-DLX6-os1转基因小鼠，此小鼠可与多种不同器官带有cre酶的转基因小鼠杂交，得到在不同器官中降低DLX6-os1表达水平的小鼠，具体是：

（1）、构建载体

构建Dlx6-os1条件敲除载体，Dlx6-os1基因，转录物：Dlx6-os1-201ENSMUST00000159568.5，位于小鼠6号染色体上的三个外显子，以三个外显子作为条件敲除区域，删除该区域应导致小鼠Dlx6-os1基因功能丧失；

将C57BL / 6小鼠基因文库中RP24-276P7 and RP24-260F14的BAC克隆作为模板，进行PCR，获得试验所需要的目的载体及敲除区域；

在目的载体中，Neo位点旁插入自删除锚定位点，基因敲除区域旁插入loxp位点，DTA用于阴性选择；

与Cre酶介导的基因重组后，得构建成功的基因敲除质粒载体；

（2）、基因动物打靶培育：

将C57bl/6 ES细胞用于基因打靶，也就是将基因敲除质粒载体导入ES细胞中，进行后续繁育，与多种不同器官带有Cre酶的转基因小鼠杂交，得到在不同器官中降低DLX6-os1表达水平的阳性小鼠。

2.根据权利要求1所述的条件性敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、构建载体

为了在C57BL / 6小鼠中创建小鼠Dlx6-os1条件敲除模型，首先构建Dlx6-os1条件敲除载体，Dlx6-os1基因，转录物：Dlx6-os1-201 ENSMUST00000159568.5，位于小鼠6号染色体上的三个外显子，以三个外显子作为条件敲除区域，删除该区域应导致小鼠Dlx6-os1基因功能丧失；

A、用高保真Taq DNA聚合酶从BAC克隆扩增含有同源臂和条件敲除区域的小鼠基因组片段，并将其与下面显示的重组位点和选择标记一起依次组装成靶向载体：

（1）、从BAC DNA中PCR扩增目的片段，电泳检测扩增产物，切胶回收目的片段；

PCR引物：上游引物No1：GTTATCAGCAAGCAGATTCTCATTG

下游引物No1：GACTCACCATCTGAAACTGTAATCA

目的片段序列为SEQ ID No：1；

（2）、目的片段与基本载体连接；

（3）、连接产物转化感受态，涂平板过夜培养；

（4）、挑取单菌落，菌落PCR筛选阳性克隆；

PCR引物序列：上游引物No2：CAAGTGAAGTTCTGGGCGAGTCT

下游引物No2：CTTTTGCTGTGTTCACCAAGCCTT

（5）、菌落PCR阳性克隆小提质粒，进行酶切鉴定；

（6）、酶切鉴定的阳性克隆进行测序验证；

测序引物序列：上游引物No3：CTATGACTAAGGGCTCTAACTATCTC

下游引物No3：TGAGATGCTTGGCCGAGTGTTCAGT

（7）、测序：对引物进行测序，测序正确，证明目的片段已成功连接入基本载体，保存阳性克隆菌株，质粒用于连接其余片段；

（8）、目的片段连接完成，获得最终载体，进行后续质粒制备及线性化；

B、质粒制备：

（1）、将前述连接目的片段的最终载体质粒转化大肠杆菌；

（2）、摇菌提取质粒；

（3）、MN质粒纯化试剂盒纯化质粒并用超纯水溶解；

（4）、酶切验证质粒，进行质粒线性化；；

（5）、酶切验证线性化质粒；

（6）、电泳线性化质粒，切胶回收目的片段；

（7）、酶切验证回收的线性化产物；

（8）、线性化载体质粒，用于后续ES细胞打靶；

在靶向载体中，Neo盒侧翼为自身缺失锚位点，条件敲除区域侧翼为loxP位点，DTA用于阴性选择；在Cre介导的重组后将获得组成型KO等位基因，载体构建成功后将用于C57BL /6 ES细胞的基因动物打靶培育；

二、基因动物打靶培育：

将靶向的ES 细胞克隆6F4 注射到C57BL/6 白化胚胎中，然后将其重新植入CD-1 假妊娠雌性中，通过其毛色辨别亲本，用C57BL/6 雌性育种并随后对后代进行基因分型确认种系传递：

A、ES打靶-电转

（1）、培养ES细胞；

（2）、胰酶消化，进行细胞计数，确定细胞量足够电转；

（3）、离心收集细胞，加入电转缓冲液和线性化质粒DNA，冰浴片刻，将混合物加入电转杯进行电转；

（4）、电转后冰浴片刻，接种与ES培养基中；

（5）、培养过夜，次日加药，进行抗药性筛选；

（6）、继续培养，待细胞生长稳定后，挑单克隆于96孔板；

（7）、将96孔板ES细胞转移至新的96孔板，传代培养；

（8）、细胞生长稳定后，96孔板细胞送检PCR，做初次打靶筛选；同时，备份板于-80℃保存；

B、ES打靶-PCR筛选：

（1）、SDS裂解液和蛋白酶K混合液裂解96孔板ES细胞，过夜裂解；

（2）、次日，用无水冰乙醇和氯化钠混合液沉淀基因组DNA；

（3）、质量浓度70%乙醇清洗沉淀，去除残留乙醇，加入RNAaseA 和注射水混合液，封口37℃培养箱过夜，作为PCR模板；

（4）、准备96孔PCR板，进行PCR扩增及电泳检测；

PCR引物：

5’arm-F (P1): 5’-CTACTAGCCACATGCTTCTCTTGTGAGG-3’

5’arm-R (P2): 5’-TCGAACTTGTGGCCGTTTACGTG-3’

野生型: N.A.；

基因敲除:～2.7 kb；

Distal loxP PCR:

Distal-loxP-F (P3): 5’-GCCCCAAACTAGAAATCCCTCATC-3’

Distal-loxP-R (P4): 5’-TTGTATGGAGTTGACCCAAAGGGAG-3’

Wildtype: 238 bp

Targeted: 325 bp；

（5）、电泳完成，记录检测结果；

C、ES打靶-细胞复苏传代：

（1）、准备细胞复苏所需试剂及物品；

（2）、取出-80℃冻存的备份板；

（3）、将PCR阳性克隆从96孔板传代至12孔板；

（4）、12孔板细胞生长稳定后，传至6cm培养皿；

（5）、再将6cm培养皿细胞传至10cm培养皿；

（6）、待细胞生长稳定后，消化，离心收集细胞，一部份冻存；一部分送检SouthernBlot；

D、ES打靶-Southern Blot

（1）、PCR法制备地高辛标记探针；

（2）、ES细胞基因组DNA的抽提；

（3）、基因组DNA酶切，酶切产物进行电泳分离；

（4）、电泳凝胶转膜，将凝胶上的DNA转移至尼龙膜；

（5）、紫外交联固定尼龙膜；

（6）、DNA预杂交；

（7）、预杂交完成后，进行杂交过夜；

（8）、杂交后，进行洗膜和阻断；

（9）、加入抗体孵育，洗涤缓冲液洗涤后，加入检测缓冲液平衡；

（10）、将膜放入底物显色液中，避光显色，使用碧云天公司显色试剂盒（C3206

（12）、显色完成，洗膜缓冲液洗涤，观察结果；

E、囊胚注射：

（1）、从交配后3.5天的供体母鼠子宫内获取囊胚；

（2）、安装显微注射设备，准备所需试剂及物品；

（3）、挑选形态良好、发育状态适中的囊胚，转移至注射皿的培养基内；

（4）、将待注射ES转移至注射皿的细胞培养基内，使其均匀排列，密度适中；

（5）、将ES细胞吸入注射针，将其逐个注射入囊胚腔；

（6）、注射完成后，可在囊胚腔内看到ES细胞；

F、代孕鼠制备及胚胎移植：

（1）、选取适龄的母鼠与结扎公鼠合笼，获取代孕母鼠；

（2）、将注射ES细胞的囊胚移植入代孕母鼠的子宫内；

（3）、将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养；

（4）、囊胚移植完成，待嵌合体小鼠出生；

（5）、嵌合体出生1周后编号,3周后 进行分笼；

G、F1小鼠繁殖：

（1）、雄性嵌合体出生满8周，与8周龄母鼠，B6或Floxp/Cre工具鼠合笼；

（2）、出生小仔放入新的笼盒，并进行编号；

（3）、待1周龄左右剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；

（4）、保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄左右剪鼠尾送检PCR，进行二次鉴定；

（5）、经2次PCR鉴定阳性的小鼠，为正确打靶的杂合子小鼠，实现条件性敲除lncRNADLX6-os1转基因小鼠的培育。