[发明专利]脐带间充质干细胞MSCs及其培养方法和应用

说明书

本发明涉及一种脐带间充质干细胞MSCs及其培养方法和应用，属于生物医药技术领域。该培养方法包括MSCs培养步骤：原代培养：取脐带的华通胶组织，以无血清培养基在低氧条件下培养；传代培养：收集上述P1原代细胞，制得单细胞悬液，离心获得细胞沉淀；向该细胞沉淀中加入无血清培养基，在低氧条件下培养至传代，连续培养到P2‑P3代；每次传代培养时加入盐酸川芎嗪和参麦注射液，待细胞长至预定融合度时，消化、至P6代收集细胞；表型检测：对上述收集得到的细胞进行表型检测，待用。采用该方法培养得到的MSCs制剂，降低了干细胞容易聚集成团特性，从而避免静脉输注进入人体后出现细胞粘附、缗钱状红细胞，细胞团栓塞的情况，使MSCs干细胞技术更好地应用于临床。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种脐带间充质干细胞MSCs及其培养方法和应用。

背景技术

据世界卫生组织预测，至2020年，非传染性疾病将占我国死亡原因的79％，其中心血管病将占首位。由于心肌细胞是终末分化细胞，坏死细胞不能再生，只能通过瘢痕形成来代替，导致心肌收缩功能丧失，发生顽固性心力衰竭而死亡。根据我国50家三甲医院病例调查显示：心衰的住院率虽然占同期心血管病的20％，但死亡率却占40％。五年的存活率与恶性肿瘤相仿。临床药物、介入和手术治疗都属于被动、补救性治疗，不能替代坏死的心肌；而心脏移植由于供体困难在临床上很难推广。与此同时，干细胞移植提供了一种全新的治疗方法。

脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞。在体外特定的诱导条件下，可分化为成纤维细胞、脂肪细胞、血管上皮细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、胰岛β细胞和内皮细胞等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。MSCs免疫源性低，不论是自体还是同种异源的MSCs，一般都不会引起宿主的免疫反应。MSCs有向衰退、缺血或损伤组织聚集的特性，这种特性医学上称为归巢现象。MSCs存在于脐带、成体间质组织中及骨髓、乳牙等处，其中，骨髓间充质干细胞(BMSC)只占骨髓有核细胞总数的1/10000-100000，MSCs在胎盘及脐带中大量存在，而且较纯净。国内外学者在体外培养中将MSCs经细胞传代后用5-氮胞苷(azacytidine,5-aza)对其进行诱导分化，可见有心肌细胞样超微结构，有心肌特异性基因表达，并有持续的动作电位，表明他们成功地诱导出心肌细胞。另有学者将MSCs直接注入自体心肌组织内，发现有心肌样细胞形成，具有肌钙蛋白T和肌球蛋白重链的心肌细胞特异性标志，表明MSCs在体内微环境条件下可以诱导分化为心肌细胞。

目前对MSCs的培养条件意见不统一，对于培养条件，如培养箱的氧气密度、湿度等，培养基的选择，血清的种类和浓度，首次换液的时间、换液频率和换液的液体量等各种因素都将影响MSCs的增殖。现在普遍的MSCs体外培养的体系是在常氧浓度的完全培养基中培养，完全培养基通常含有动物胎牛血清。

然而，由于不同年龄、不同组织来源中提取的间充质种子干细胞的活力潜力有差异，而培养方法的不同也很大方面影响了MSCs的特性,MSCs能够高表达CXCR4(细胞趋化因子受体4)，但经过常氧下培养后CXCR4表达能力明显降低。用胎牛血清培养方法可能因为MSCs输注人体后由于动物血清残存而引起的血清病，不利于干细胞治疗的临床应用。并且，静脉输注的体外培养的MSCs，只有极少数MSCs能植入人体或动物受伤处，多数细胞滞留于微血管处(特别是肺部)而死亡。同时，MSCs有贴壁生长的特性，在体外培养也经常出现MSCs成团现象，因此在静脉输注进入人体后会出现干细胞粘附、聚集成团，细胞团栓塞的情现象。

以上原因使体外培养的MSCs都会在治疗疾病上带来不良反应、影响疗效，阻碍干细胞的临床治疗开展。

发明内容