[发明专利]一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法

权利要求书

1.一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的非诊断目的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：取至少四个PCR管，并分别编号为阳性对照管、阴性对照管、实验管及空白对照管，配制20µL 的PCR扩增体系；其中，

阳性对照管中加入15～18µ L PCR反应液、0.5～1.5µ L上游引物、0.5～1.5µ L下游引物及1～2µ L阳性对照；

阴性对照管中加入15～18µ L PCR反应液、0.5～1.5µ L上游引物、0.5～1.5µ L下游引物及1～2µ L阴性对照；

实验管中加入15～18µ L PCR反应液、0.5～1.5µ L上游引物、0.5～1.5µ L下游引物及1～2µ L待检测的鲍曼不动杆菌样品；

空白对照管中加入15～18µ L PCR反应液、0.5～1.5µ L上游引物、0.5～1.5µ L下游引物及1～2µ L灭菌水；

所述上游引物序列为：5’-TTGAGAAGCTAAATTATGGCTCG-3’，

所述下游引物序列为：5’-GATAGCACAGAAATCCATAAAGGAA-3’；

S2：将经步骤S1所得的PCR扩增体系分别在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪中扩增；

S3：将经步骤S2扩增反应后的产物分别进行电泳，观测91bp处对应是否出现条带，并作结果分析；

所述阳性对照为经全基因组测序确定含有生物标志物且动物实验呈高致死率的临床鲍曼不动杆菌菌株核酸；所述阴性对照为经全基因组测序确定不含有生物标志物且动物实验呈非致死性的临床鲍曼不动杆菌菌株核酸；

所述生物标志物为鲍曼不动杆菌内一段特异性序列，且该特异性序列存在于鲍曼不动杆菌内一段包括19个开放读码框的基因序列中，包括19个开放读码框的基因序列如SEQ IDNO.1所示，特异性序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的非诊断目的检测方法，其特征在于，在S1中，所述待检测的鲍曼不动杆菌样品OD600nm为0.6～0.8。

3.根据权利要求1所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的非诊断目的检测方法，其特征在于，所述PCR反应液包括耐热DNA聚合酶、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、氯化镁溶液、氯化钾溶液、曲拉通溶液、甲酰胺溶液以及脱氧核糖核苷三磷酸。

4.根据权利要求3所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的非诊断目的检测方法,其特征在于，在所述PCR扩增体系中，耐热DNA聚合酶浓度为5U/µ L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液浓度为200mmol/L、氯化镁溶液浓度为20mmol/L、氯化钾溶液浓度为500mmol/L、曲拉通溶液体积比为0.2%、甲酰胺溶液体积比为10%以及脱氧核糖核苷三磷酸浓度为10mmol/L。

5.根据权利要求1或4所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的非诊断目的检测方法,其特征在于，在所述PCR扩增体系中，所述上游引物及下游引物浓度均为0.5µ mol/L。

6.根据权利要求3或4所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的非诊断目的检测方法，其特征在于，所述耐热DNA聚合酶包括Taq聚合酶。

7.根据权利要求1所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的非诊断目的检测方法， 其特征在于，扩增反应的条件为：在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在57～63℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持。