[发明专利]一种鸭小肠上皮细胞的培养方法及应用

权利要求书

1.一种鸭小肠上皮细胞的培养方法，其特征在于：该培养方法包括如下步骤：

步骤1，取孵化26天的麻鸭种蛋，无菌操作取出鸭胚小肠组织，置于DPBS中；

步骤2，去除组织中的小肠系膜和胰腺后，将小肠剖开再次用DPBS漂洗，洗至上清液清亮，将小肠剪碎后备用；

步骤3，采用1mg/ml的I型胶原酶消化剪碎的组织团块，37℃，80r/min振荡消化70min；

步骤4，使用DPBS轻柔清洗消化后的组织团块2次，弃除DPBS，保留组织块；

步骤5，37℃的DPBS轻轻吹打清洗后的组织团块，收集上层细胞悬浮液，保留组织块继续使用DPBS清洗，重复本步骤7-8次，直至上清液清亮；

步骤6，收集获得的细胞悬浮液1000r/min离心3min，弃上清；

步骤7，离心获得的细胞团用完全培养基培养吹打重悬，过100μm网筛过滤；

步骤8，过筛后的细胞轻轻吹打均匀后，将其接种到细胞培养瓶中，37℃，5％CO₂条件下培养90min，去掉贴壁细胞；

步骤9，收集未贴壁细胞，细胞按照10×10⁶/mL密度接种于细胞培养板，37℃，5％CO₂培养24小时，获得鸭原代小肠上皮细胞；

所述DPBS为38.8mL PBS磷酸缓冲液+1.2mL双抗。

2.如权利要求1所述的一种鸭小肠上皮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤7中的完全培养基为：46.65mL DMEM/F12，2.5mL FBS，0.25mL100μg/mL肝素钠，0.05mL 10⁵ng/mlEGF，0.05mL25mg/ml胰岛素，0.5ml10000U青链霉素。

3.一种鸭小肠上皮细胞的氧化应激模型建立方法，其特征在于：

步骤1：采用如权利要求1所述鸭小肠上皮细胞的培养方法制备原代小肠上皮细胞：

步骤2：采用过氧化氢诱导处理鸭原代小肠上皮细胞，所述过氧化氢诱导处理鸭原代小肠上皮细胞的浓度为200μM，处理时间为4h。

4.如权利要求3所述的鸭小肠上皮细胞的氧化应激模型建立方法，其特征在于：分别设对照组和氧化应激处理组，用不含双抗的完全培养基对鸭原代小肠上皮细胞进行半换液，37℃，5％CO₂培养箱中培养12h，保证细胞活力；实验组每孔加入DMEM/F12稀释的过氧化氢，采用过氧化氢体外诱导处理小肠上皮细胞，过氧化氢浓度为200μM，处理时间为4h；空白对照组加入等量的DME/F12，37℃，5％CO₂培养箱中孵育，采用CCK8法检测细胞存活率，用分光光度计检测相关的细胞氧化应激指标。